Podocytes are highly differentiated epithelial cells that contribute to the selective filtration barrier of the renal glomerulus. The actin-based podocyte foot processes possess a subplasmalemmal actin network and a central core of actin filament bundles. The dynamic regulation of the podocyte actin cytoskeleton is vital to kidney function. Nephrin, identified as a slit diaphragm protein, connects foot processes from adjacent podocytes, which is critical for the structural and functional integrity of podocytes. It has been reported that tyrosine phosphorylation of nephrin was responsible for its interaction with PI3-kinase and Nck. PI3-kinase and Nck-Pak signalings are well known regulators of actin dynamics. Therefore, we studied the role of PI3-kinase and Nck-Pak signalings activated via the tyrosine phosphorylation of nephrin, in actin cytoskeleton organization of cultured podocytes. We identified that Y1152 of rat nephrin was responsible for nephrin -PI3K interaction. Stable transfection of rat nephrin in the podocytes with podocin led to nephrin tyrosine phosphorylation, PI3K-dependent phosphorylation of Akt, increased Rac1 and Pak activity, and actin cytoskeleton reorganization with decreased stress fiber and increased lamellipodia. These actin cytoskeleton changes were reversed with an inhibitor of PI3K and not seen when the nephrin mutant Y1152F replaced wild type nephrin. Pak was coimmunoprecipitated with nephrin and Nck in vitro and in vivo. The nephrin increased Pak phosphorylation was completely abolished by a nephrin mutantY1208/1224F (fail to bind Nck), but not affected by the Rac1 inhibitor. Dominant negative Nck constructs blocked Pak1 phosphorylation induced by antibody-mediated cross-linking of nephrin. Transient transfection of constitutively kinase active Pak1 into differentiated mouse podocytes decreased stress fibers and increased cortical F-actin, while kinase-dead mutant, kinase inhibitory construct, and Pak2 knockdown by shRNA had the op / Les podocytes sont des cellules épithéliales fortement différenciées qui contribuent à la barrière de filtration sélective du glomérule rénal. Les processus de pied de podocyte à base d'actine possèdent un réseau d'actine sous-plasmalemme et un noyau central de groupes de filaments d'actine. La dynamique de la régulation du cytosquelette d'actine podocyte est vitale pour la fonction rénale. La néphrine, identifiée comme une protéine d'une micro-membrane, relie les processus de pied des podocytes adjacents, ce qui est essentiel pour l'intégrité structurelle et fonctionnelle des podocytes. Il a été rapporté que la phosphorylation de la tyrosine de la néphrine est responsable de son interaction avec la kinase-PI3 et le NCK. La kinase-PI3 et la signalisation de NCK-Pak sont des régulateurs bien connus des dynamiques de l'actine. Par conséquent, nous avons étudié le rôle de la kinase-PI3 et la signalisation de NCK-Pak activée par l'intermédiaire de la phosphorylation de la tyrosine de la néphrine, dans l'organisation de l'actine du cytosquelette des podocytes de culture. Nous avons identifié que le Y1152 de la néphrine du rat était responsable de l'interaction PI3K-néphrine. La transfection stable de la néphrine du rat dans les podocytes avec podocine conduit à la phosphorylation de la tyrosine de la néphrine, la phosphorylation de l'Akt dépendant du PI3K, accroît l'activité du Rac1 et du Pak, et la réorganisation de l'actine du cytosquelette avec une diminution du fibres de tensions et l'augmentation de la lamellipode. Ces changements de l'actine du cytosquelette ont été renversés avec un inhibiteur de la PI3K et n'ont pas été observés lorsque le mutant Y1152F a remplacé la néphrine de type sauvage. Le Pak a été coimmunoprécipité avec la néphrine et le NCK in vitro et in vivo. L'activité de la néphrine activée par le Pak a été totalement abolie par une néphrine mutante Y1208/1224F (échec à lier NCK), mais
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.86560 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Zhu, Jian Xin |
| Contributors | Tomoko Takano (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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