The reverse transcriptase (RT) enzyme of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) is an RNA- and DNA-dependent DNA polymerase that also exhibits RNase H activity. The polymerase and RNase H active sites of RT are structurally linked through the connection domain. RT is a major antiretroviral target but the development of viral resistance often leads to therapy failure. Genotyping protocols detect mutations in the polymerase active site that confer resistance to nucleoside analogue RT inhibitors such as zidovudine (AZT). It has been shown however, that mutations outside of this region, such as the N348I substitution in the connection domain, also confer resistance to AZT. Here, we have investigated the mechanism of N348I drug resistance. Our biochemical results have shown that the N348I mutation affects drug susceptibility by reducing nucleic acid substrate binding in the RNase H domain of RT. The N348I mutation also compensates for enzymatic deficits introduced by other resistance-conferring mutations, thus providing a rationale for its selection pattern in vivo.Additionally, we have investigated the mechanism through which INDOPY-1, a newly discovered antiretroviral agent, disrupts RT function. Although INDOPY-1 is not a nucleoside analogue, it can compete with incoming nucleotides and select for mutations at the site of nucleotide binding. Based on these observations, we propose that this antiretroviral agent belongs to a new class of RT inhibitors that we name "Nucleotide-competing RT Inhibitors". Finally, cellular ATP was shown to enhance the potency of INDOPY-1, a property never before seen with any other RT inhibitors. Based on the biochemical properties of this interaction, we propose to describe ATP as an "enhancer" of INDOPY-1-mediated RT inhibition. ATP enhances the binding of INDOPY-1 to RT by "capping" the inhibitor in the polymerase active site.Work presented in this thesis characterizes a novel mechanism of resistance to clinically approved RT inhibitors. It also describes, for the first time, a new class of RT inhibitors that function through a unique mechanism of action. / La transcriptase inverse (RT) du VIH-1 est une polymérase d'ADN et d'ARN qui est aussi capable de dégrader l'ARN viral durant la polymérisation. Le domaine de connextion de la RT crée un lien entre le site actif de la polymérase et le site actif d' RNase H de cette enzyme. La RT est une cible majeure de la thérapie contre le SIDA. Mais, à cause du taux de mutation élevé du virus, le développement de résistance aux médicaments est rapide, ce qui engendre la neutralisation des effets avantageux des thérapies antivirales. Les analogues de nucléosides, comme zidovudine (AZT), sont souvent utilisés durant la thérapie anti-SIDA. Les tests génotypiques qui détectent la résistance virale incluent seulement le domaine de la polymérase de la RT. Par contre, il a été démontré que des mutations dans les domaines de la connextion, par example le mutation N348I, peuvent causer la résistance à AZT. Nous avons étudié le mécanisme de résistance à la mutation N348I. Nos resultats biochimiques montrent que N348I a un effet négatif sur l'affinité de l'ARN pour le site actif d'RNase H. Nous montrons aussi que la mutation N348I peut compenser pour des domages causés par d'autres mutations. Ceci peut expliquer l'apparence de cette mutation in vivo. Nous avons aussi étudié le mécanisme d'action d'INDOPY-1, un nouveau agent inhibatoire de la RT. Malgré que l'INDOPY-1 n'est pas un analogue de nucléoside, cet agent peut entrer en compétition avec les nucléotides et les mutations de résistance sont selectionnées dans le site d'association des nucléotides. C'est ainsi que nous avons proposé que l'INDOPY-1 appartient à une nouvelle catégorie d'inhibiteurs que nous nommons «Nucleotide-competing RT inhibitors». Un autre trait caractéristique de l' INDOPY-1 est que sa capacité d'inhibition peut être augmentée par l'ATP cellulaire. Basé sur ceci, nous décrivons l'ATP comme étant le «renforceur» de l'INDOPY-1. Ce mécanisme de renforcement se produit lorsque l'ATP «encapsule» l'INDOPY-1 dans le site actif de la polymérase de la RT.En conclusion, nous avons characterisé un nouveau mécanisme de résistance aux analogues de nucléosides. Nous avons aussi découvert le premier composé d'une nouvelle classe d'agents inhibatoires de la RT.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96722 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Ehteshami Akbari, Maryam |
| Contributors | Matthias Gotte (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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