Autophagy and apoptosis are two major signaling pathways employed by the cell in response to various stress-induced signals in order to manage such stress and ultimately to determine cellular survival or death. Central to the regulation of both pathways is the BCL-2 protein family. At the endoplasmic reticulum (ER) the pro-survival BCL-2 protein targets multiple protein complexes, which influence Ca2+ homeostasis, as well as the outcome of apoptosis and autophagy pathways. To understand how BCL-2 is partitioned between these complexes, we sought to identify BCL-2-interacting proteins at this site. Here I present the identification and characterization of NAF-1, a novel ER BCL-2-interacting partner. Interestingly, NAF-1 is required for BCL-2 antagonism of autophagy, but is not required by BCL-2 to antagonize apoptosis initiated at the ER by the BH3-only protein BIK. NAF-1 contributes to the physical interaction between BCL-2 and the autophagy effector Beclin 1, which is essential for functional inhibition of autophagy by BCL-2. Thus, NAF-1 targets BCL-2 to the autophagy pathway at the ER. Furthermore, NAF-1 is found in association with the IP3R ER Ca2+ efflux channel, and mediates BCL-2 regulation of ER Ca2+ stores. Ectopic expression of ER-targeted BCL-2 reduces ER Ca2+ content and NAF-1 is required for this process. In response to nutrient deprivation, autophagy induction is accompanied by an early release of ER Ca2+ stores. Cytosolic Ca2+ is required for autophagy in response to starvation, suggesting that the release of Ca2+ from the ER may be an essential signal for autophagy induction and, in addition to direct sequestration of Beclin 1, a mechanism of inhibition by BCL-2/NAF-1. To study the physiological contribution of the Naf-1 gene, we generated Naf-1 knockout mice. These mice begin to manifest signs of severe muscle degeneration between 2-3 months of age, and exhibit increasingly poor performance status until mortality at 6-9 months. Immortalized MEF cell lines were generated and will be utilized in conjunction with the Naf-1 knockout mice for future elucidation of NAF-1 function.In summary, this thesis provides a thorough analysis of a novel ER BCL-2-interacting partner, NAF-1, and provides further insight into the mechanism of autophagy regulation by BCL-2. / L'autophagie et l'apoptose sont les deux voies principales de signalisation employées par les cellules afin de répondre à des signaux de stress et de sélectionner la survie ou la mort cellulaire. La famille de protéines BCL-2 est l'un des éléments essentiels à la régulation de ces deux voies de signalisation. La protéine anti-apoptotique BCL-2 du réticulum endoplasmique (RE) cible plusieurs complexes de protéines, ce qui influence l'homéostasie du Ca2+, l'autophagie et l'apoptose. Afin de comprendre comme BCL-2 interagit avec ces complexes protéiques, nous avons cherché à identifier de nouvelles protéines qui interagissent avec BCL-2 dans le RE. Dans ce travail, nous montrons l'identification et la caractérisation de la protéine NAF-1, une nouvelle protéine qui interagit avec BCL-2 du RE. BCL-2 requiert la protéine NAF-1 pour antagoniser l'autophagie, mais NAF-1 n'est pas requise pour antagoniser le processus apoptotique qui est initié au RE par la protéine BIK. En outre, NAF-1 contribue à l'interaction physique entre BCL-2 et l'effecteur de l'autophagie Beclin 1. Cette interaction est essentielle à la régulation négative du processus autophagique par BCL-2. En conséquence, NAF-1 cible BCL-2 vers la voie autophagique au RE. En outre, NAF-1 s'associe au canal calcique IP3R du RE et sert également d'intermédiaire à la régulation de la réserve de calcium au RE par BCL-2. L'expression cellulaire excessive de BCL-2 au RE réduit les réserves de calcium et NAF-1 est requise pour ce processus. Pendant une carence de nutriments, l'induction autophagique est accompagnée d'une libération rapide des réserves de Ca2+ du RE. Puisque le calcium cytosolique est requis pour initier l'autophagie induite par la famine, nos travaux suggèrent que la libération de Ca2+ à partir du RE peut agir comme signal à l'initiation de l'autophagie. Alors, le complexe BCL-2/NAF-1 peut servir, en plus de la séquestration directe de Beclin 1, comme mécanisme d'inhibition de ce signal calcique. Afin d'étudier la contribution physiologique du gène Naf-1, nous avons produit de souris KO du gène Naf-1. Ces souris manifestent des signes de dégénérescence musculaire sévère entre 2-3 mois d'âge. Elles démontrent une détérioration croissante de leurs performances au cours de leur vie, et ce, jusqu'à leur mort à 6-9 mois d'âge. Afin d'éclaircir le rôle de NAF-1, des lignées cellulaires immortalisées MEF ont été générées et elles seront utilisées en combinaison avec les souris KO du gène Naf-1. En résumé, d'une part, cette mémoire fournit une analyse approfondie d'un nouveau partenaire du BCL-2 au RE, NAF-1. D'autre part, elle permet de mieux cerner le mécanisme de régulation de l'autophagie par BCL-2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96668 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Chang, Natasha |
| Contributors | Gordon C Shore (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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