The field of subcellular proteomics aims to describe and analyze all the proteins present in a precise subcellular compartment at a given time. In contrast to whole-cell or whole-organism proteomics, the analysis of individual organelles has provided simpler proteomes from which relevant biological information could be more easily derived. To date, the protein complement of several subcellular structures, including the mitochondria, lysosome, peroxysome, phagosome and nucleus has been described. The powerful and rapidly evolving instrumentation as well as the development of biochemical and bioinformatics tools now allow scientists to derive whole organelle models based on the proteomic data generated. This field however still faces numerous challenges. Among those is the analysis of membrane-associated proteins, whose large and hydrophobic character complicate their extraction, subsequent separation and analysis by mass spectrometry. Another emerging limitation in subcellular proteomic resides in the difficulty in collecting enough material of a very pure preparation of the organelle of interest, which still depend on lengthy and labor-intensive density-based centrifugation as the method of choice for subcellular fractionation. The work presented in this thesis describes the development of new methods for subcellular proteomics that address the above-mentioned limitations, and their application to relevant biological models. In chapter 2, we present the design of a non-discriminatory investigative approach to study membrane proteins. Relying on detergent-free and gel-free procedures, this strategy allowed identification of hundreds of cell surface-exposed proteins from freshly ejaculated bovine spermatozoa, as presented in chapter 3. Diverging from traditional cell fractionation protocols, we have refined in chapter 4 a fluorescence-assisted organelle sorting method and have employed it to acquire the proteome of corticotropes-derived secretory granules. Our proc / Le domaine de la protéomique subcellulaire vise à décrire et analyser toutes les protéines présentes dans un compartiment subcellulaire précis à un temps donné. Contrastant avec la protéomique des cellules ou d'organismes complets, l'analyse d'organelles individuelles a généré des protéomes plus simples desquels l'information biologique pertinente peut être plus facilement extraite. À ce jour, le complément de protéines de plusieurs structures subcellulaires, incluant la mitochondrie, le lysosome, le peroxysome, le phagosome et le noyau a été décrit. L'évolution rapide et la puissance de l'instrumentation disponible couplées au développement d'outils biochimiques et bioinformatiques permettent maintenant aux scientifiques de générer des modèles d'organelles complets basés sur les données générées par la protéomique. Ce domaine, cependant, fait toujours face à plusieurs défis. Parmi ceux-ci, on doit mentionner l'analyse des protéines associées à la membrane dont la taille et l'hydrophobicité compliquent l'extraction, la séparation subséquente et l'analyse par spectrométrie de masse. Une autre limitation émergeante en protéomique subcellulaire est l'obtention d'une préparation très pure d'organelles d'intérêt et ce, en quantité suffisante, qui dépend toujours de longues et laborieuses centrifugations basées sur la densité comme méthode de choix pour la fractionnement subcellulaire. Le travail présenté dans cette thèse décrit le développement de nouvelles méthodes en protéomique subcellulaire qui s'adressent aux défis mentionnés précédemment, et leur application à des modèles biologiques pertinents. Dans le chapitre 2, nous présentons l'élaboration et la mise au point d'une approche investigatrice non discriminatoire pour étudier les protéines de membrane. Basée essentiellement sur des procédures sans détergent et sans gel de séparation, cette stratégie a permis l'identification de centaines$
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.18721 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Gauthier, Daniel |
| Contributors | Claude Lazure (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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