Coxsackie and adenovirus receptor (CAR), a binding receptor shared by subfamilies of Coxsackie viruses and adenoviruses, is an adhesion molecule which plays critical roles in development. CAR is also a putative tumor suppressor, and its expression is silenced or downregulated in a variety of tumor types. However, it is not known how CAR exerts its physiological functions. Our lab has previously reported that CAR is a potent suppressor of glioma cell migration, invasion and tumor growth in vivo, and that the cytoplasmic domain of CAR is required for these inhibitory effects, but the underlying mechanism is not entirely understood.In this thesis, we focused on characterizing the role of the four tyrosine residues, Y269, Y294, Y313 and Y318 in the cytoplasmic domain of CAR. These tyrosines were individually mutated to alanines, followed by expression in a CAR-negative glioma cell model. We found that while Y269 plays a role in mediating adenovirus infection, Y294 plays a role in STAT5 signaling during glioma cell migration. In the context of our studies on Y294, we observed that wild-type CAR inhibits STAT5 activation, its nuclear translocation, expression of its target genes and cell migration induced by growth factors, such as epidermal growth factor (EGF) and insulin growth factor 1(IGF-1). In contrast, Y294A abrogated the inhibitory function of CAR in STAT5 activation, target gene expression and cell migration, suggesting that Y294 is critical for CAR regulation of STAT5 signaling during cell migration. During these studies we also observed that introduction of wild-type CAR into various glioma cell lines invariably resulted in a decrease in the size of the cell nucleus. Three-dimensional reconstruction of confocal images further revealed that nuclear volume was diminished in CAR-expressing cells. Importantly, specific knockdown and conditional knockout of CAR in primary astrocytes resulted in increased nuclear size, suggesting that CAR-mediated nuclear size control is physiologically relevant. CAR localization on the plasma membrane was required for its effect on nuclear size, which could be abrogated by incubation of cells with a neutralizing antibody against the extracellular domain of CAR. We show that an intact cytoplasmic domain, specifically the distal 26 amino acids, is essential for control of the nuclear size in CAR-expressing cells. This domain was previously shown by our lab to interact with actin. Here we provide biochemical and electron microscopic evidence that CAR controls nuclear size and shape through its impact on the polymerization and bundling of the perinuclear actin network. While other tyrosine mutants have the same effect as CAR in reducing nuclear size, the CAR-Y318A does not reduce nuclear size, suggesting that Y318 might play a role in regulating CAR-mediated nuclear size control.In summary, we found that the tyrosine residues in the cytoplasmic domain of CAR play critical roles in various physiological processes, including cell migration, virus infection and nuclear size control. This study extends our understanding on the roles of CAR in cell migration and nuclear size control. / Le récepteur CAR est un récepteur de liaison utilisé par des sous-familles de virus Coxsackie et des adénovirus. CAR est une molécule d'adhésion qui joue un rôle crucial dans le développement de l'organisme. CAR est également considéré comme un suppresseur de tumeur, et son niveau d'expression est diminué ou absent dans une variété de tumeurs. Cependant, on ne connaît pas le mécanisme d'action de CAR dans ces fonctions physiologiques. Notre laboratoire a déjà rapporté que CAR est un suppresseur puissant de la migration des cellules de gliome, de leur invasion et de la croissance tumorale in vivo, et que le domaine cytoplasmique de CAR est nécessaire pour ces effets inhibiteurs, mais le mécanisme sous-jacent n'est pas entièrement connu.Dans cette thèse, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation du rôle des quatre résidus tyrosine Y269, Y294, Y313, Y318 qui se retrouvent dans le domaine cytoplasmique de CAR. Par la mutation dirigée, ces tyrosines ont été remplacés par des alanines, et le CAR muté a été exprimé dans des cellules de gliomes qui étaient CAR-négatif. Nous avons constaté que Y269 joue un rôle dans la voie d'infection de l'adénovirus, et que Y294 joue un rôle dans la voie de signalisation du facteur STAT5 lors de la migration des cellules de gliome. Dans le cadre de nos études sur Y294, nous avons observé que le CAR type sauvage inhibe l'activation de STAT5, ainsi que sa translocation nucléaire, l'expression de ses gènes cibles et la migration cellulaire induite par des facteurs de croissance tels que le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance insuline 1 (IGF-1). En revanche, Y294A abolit la fonction inhibitrice de CAR envers l'activation de STAT5, l'expression de ses gènes cibles et la migration des cellules, ce qui suggère que Y294 est critique pour la régulation par CAR de la voie de signalisation STAT5 pendant la migration cellulaire.Au cours de ces études, nous avons également observé que l'introduction du CAR type sauvage dans différentes lignées cellulaires de gliomes entraînait invariablement une diminution de la taille du noyau de la cellule. En outre la reconstruction tridimensionnelle des images acquises par microscopie confocale a révélé que le volume nucléaire était aussi diminué dans les cellules qui exprimaient CAR. Le knockdown spécifique et knock-out conditionnel de CAR dans les astrocytes primaires résulta en une augmentation de la taille nucléaire, ce qui suggère que CAR contrôle la taille nucléaire d'une façon physiologique. Nous avons démontré que ces effets nécessitaient que CAR soit à la membrane plasmique et que son domaine cytoplasmique soit intact, en particulier les derniers 26 acides aminés du C-terminus. Notre laboratoire a déjà démontré que ce domaine intéragit avec l'actine. Dans cette thèse nous montrons par analyses biochimiques et microscopie électronique que CAR contrôle la taille et la forme nucléaire par son impact sur la polymérisation et le regroupement du réseau d'actine périnucléaire. Alors que d'autres mutants tyrosine ont le même effet que CAR type sauvage dans la dimunition de la taille du noyau, le CAR-Y318A n'a aucun effet sur la taille nucléaire, ce qui suggère que Y318 pourrait jouer un rôle dans la régulation de la taille nucléaire par CAR.En résumé, nous avons constaté que les résidus de tyrosine dans le domaine cytoplasmique du CAR jouent un rôle crucial dans divers processus physiologiques, y compris la migration cellulaire, l'infection par l'adénovirus et le contrôle de la taille du noyau. Cette étude élargit notre compréhension des rôles de CAR dans la migration cellulaire et le contrôle de la taille du noyau.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.117106 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Chen, Hui |
| Contributors | Josephine Nalbantoglu (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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