The enzyme DNA methyltransferase 3-like (DNMT3L) is essential for de novo DNA methylation in germ cells, proper germ cell development, and has been reported as the first paternal effect gene in mammals. In mice, although Dnmt3L heterozygous or haploinsufficient (+/-) males are fertile, there are associated chromosomal compaction abnormalities and the males have been shown to sire an increased number of aneuploid offspring even if the offspring do not possess the mutant allele (the paternal effect). Despite this, there have been no reported DNA methylation abnormalities in Dnmt3L haploinsufficient mature male germ cells. This is unexpected as DNMT3L's only known function is its role in DNA methylation and some of the phenotypes seen in Dnmt3L+/- males were observed in sperm. Therefore we assessed DNA methylation defects in Dnmt3L haploinsufficient mature sperm using a genome-wide, bisulfite sequencing based method, reduced representation bisulfite sequencing (RRBS). Our experiments revealed a total of 367 hypomethylated sites and 88 hypermethylated sites found in the sperm of Dnmt3L+/- as compared to wildtype mice. These differentially methylated sites were determined by comparing 100bp genomic tiles that had DNA methylation levels that were at least 20% different between Dnmt3L+/+ (n=4) and +/- (n=5) sperm. The hypomethylated regions were mainly found in intergenic LINE1 sequences, while the hypermethylated regions were found more frequently in regulatory and exonic sequences. The findings confirm that a dosage change, without complete obliteration, of a key epigenetic regulator in the male germline can result in DNA methylation abnormalities. These gene dosage effects associated with Dnmt3L haploinsufficiency also prompted us to test the effects of Dnmt3L overexpression in the murine germline. Therefore we created a transgenic mouse model that overexpresses endogenous DNMT3L at a higher level than in wildtype germ cells. This model was successfully created and initial mating trials of the F0 revealed a trend toward female sub-fertility. Although preliminary, it appears as though the overexpression of Dnmt3L in the mouse using a germ cell specific promoter is of greater consequence to the female germline in comparison to that of the male. / L'enzyme ADN méthyltransférase 3-like (DNMT3L) est essentielle durant l'établissement initial de la méthylation de l'ADN dans les cellules germinales ainsi que dans le développement de ces dernières. Dnmt3L est le premier gène à effet paternel caractérisé chez le mammifère. Bien que les mâles Dnmt3L hétérozygotes (+/-) sont fertiles, ils démontrent des anomalies au niveau de la compaction chromosomique et de l'expression des gènes post-méiotiques. La descendance de ces mâles démontre des taux d'aneuploïdies supérieurs, et ce même si la progéniture ne possède pas d'allèle mutante (effet paternel). Malgré ces faits, aucune perturbation de la méthylation d'ADN n'a été exposée dans les cellules germinales matures de mâles Dnmt3L haploinsuffisants. Cette situation est énigmatique puisque les seules fonctions rattachées à DNMT3L sont un rôle dans la méthylation d'ADN et certains phénotypes observés dans les spermatozoïdes de mâles Dnmt3L+/-. Conséquemment, nous avons examiné les irrégularités de méthylation d'ADN, causé par une haploinsuffisance de Dnmt3L, dans les spermatozoïdes matures et ce à l'échelle du génome entier par technique de représentation réduite de séquençage bisulfite (RRBS). Nos travaux ont révélé qu'un total de 367 régions hypométhylées et 88 régions hyperméthylées dans les spermatozoïdes de Dnmt3l+/- en comparaison avec les souris de type sauvage. Ces loci différentiellement méthylés ont été déterminés en comparant des tuiles génomiques de 100 pb démontrant au moins 20% de différence entre les spermatozoïdes Dnmt3L+/+ (n=4) et Dnmt3+/- (n=5). Les régions hypométhylées sont principalement retrouvées dans les séquences intergéniques LINE1, tandis que les régions hyperméthylées sont plutôt localisées à l'intérieure de séquences régulatrices et exoniques. Nos résultats confirment qu'un simple changement de dosage, sans complètement annihiler l'expression, d'un régulateur épigénétique clé à l'intérieur des cellules germinales mâles engendre la déformation des patrons de méthylation de l'ADN. Les conséquences associées à l'effet-dose, due à l'haploinsuffisance de Dnmt3L, nous ammène à s'interroger sur la répercussion qu'aurait une surexpression Dnmt3L dans la lignée germinale murine. Par conséquent, nous avons créé un modèle de souris transgénique qui surexprime une forme endogène de DNMT3L à un niveau plus élevé que des cellules germinales de type sauvage. Ce modèle a été créé avec succès et les essais d'accouplement initiaux de la F0 révèlent une tendance de sous-fertilité des femelles. Bien que les résultats soient préliminaires, il semble que la surexpression de Dnmt3L chez la souris, en utilisant un promoteur spécifique aux cellules germinales, a des conséquences plus sévères au niveau de la lignée germinale femelle comparativement à celle du mâle.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.116966 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Farag, Mena |
| Contributors | Jacquetta M Trasler (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Human Genetics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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