Introduction: Numerous reports have shown that recombinant BMPs have positive effects in several conditions associated with poor bone formation. We hypothesize that by inhibiting BMP antagonists Noggin and Chordin using RNA interference we may upregulate endogenous BMP expression and enhance osteogenesis. Methods: MC3T3-E1 cells were transduced with lentiviruses expressing various shRNAs targeting the mouse Noggin (5 shRNAs) and Chordin (3 shRNAs) genes and 1 negative control. At various time points after infection, levels of RNA expression for Noggin and Chordin were monitored through RT-PCR. Western blotting were performed on the cell extracts and culture media to verify the expression and secretion of Noggin and Chordin proteins. Cell extracts were also analyzed on day 2 and 4 after transduction for alkaline phosphastase activity which is a marker of osteogenic differentiation. DO was performed on the right tibia of 54 wild-type mice using a miniature Illizarov distraction device. Animals were randomized into two major groups according to the time of sacrifice: end of distraction (day 17) and mid-consolidation (day 34). Each major group was sub-divided in 3 subgroups representing the type of injection that was administered at the site of distraction on day 8. For each time point, 9 mice were injected with PBS, 9 with a lentivirus plasmid containing a Non-Target (NT) shRNA and 9 with lentivirus plasmids containing shRNAs targeting Noggin-Chordin. To evaluate the success of the infection a GFP marker was added to lentivirus plasmid targeting Noggin-Chordin. For each subgroup 6 collected samples were studied using Faxitron X-ray, μCT and immunohistochemistry and 3 were studied using Rt-PCR. Results: On non-tranduced MC3T3-E1 cells, the levels of RNA expression of Noggin and Chordin was at its highest level on Day 7. At this timepoint, qRT-PCR analysis showed that the shRNAs were effective in knocking down Noggin and Chordin endogenous mRNA levels down to 10% and 17%, respectively, by the most potent of shRNAs tested compared to control. Western Blot analysis also corroborates that the respective shRNAs were effective in knocking down the Noggin and Chordin proteins. Specific activity of alkaline phosphatase was increased in MC3T3-E1 cells stably expressing Noggin and Chordin shRNA.Concerning our in vivo work, all the surgeries and distraction were successful except for the death of 2 animals secondary to post-operative complications. However, at the time of the injection the majority of the injection content was extravasating out of the injection site. Once the samples collected, the Faxitron X-ray and μCT studies did not show a significant difference of bone volume or in the ratio of bone volume/tissue volume at the distraction site in between the 3 injection subgroups at both time points. The Rt-PCR studies did not show a significant difference in inhibiting Noggin or Chordin mRNA levels in between the 3 subgroups at both time points. Finally, the immunohistochemistry studies were stopped after the GFP marker was found in all the three subgroups. Conclusion: In our in vitro study, western blot analysis, qRT-PCR and ALP assay were consistent with a successful knockdown of Noggin and Chordin. During our in vivo study, the main issues faced during this project were technical problems during the injection. Unfortunately, our study did not show any significant difference in bone formation after using injection of lentivirus plasmid with shRNA targetting BMPs antagonists Noggin and Chordin. / Introduction: Plusieurs études ont demontré que l'utilisation des BMPs ont des effets positifs sur plusieurs conditions associées avec une mauvaise formation osseuse. Notre hypothèse est qu'en inhibant les antagonites des BMPs Noggin et Chordin en utilisant une technique d'interférence de l'ARN nous pourrions augmenter l'expression endogène des BMP et par le fait même augmenter l'osteogénèse. Methodes: Les cellules MC3T3-E1 furent transfectées avec les lentivirus qui expriment différents shRNAs visant Noggin (5 shRNAs) et Chordin (3 shRNAS) chez la souris. Un contrôle négatif fut aussi sélectionné, NT (Non-Target shRNA). À différents temps après l'infection, les niveau d'expression d'ARN furent mesurés à l'aide d'un RT-PCR. Des études de Western blot furent performées sur les extraits cellulaires et sur les milieux de culture pour vérifier l'expression et la sécrétion des protéines Noggin et Chordin. Des extraits cellulaires furent aussi analysés au jour 2 et 4 après l'infection pour mesurer l'activité de l'alkaline phosphatase, qui est un marqueur de la différentiation osteogenique.Par la suite, une distraction osseuse a été réalisée sur le tibia droit de 54 souris de type sauvage à l'aide d'un miniature fixateur externe Ilizarov. Les animaux étaient randomisés en 2 groupes selon leur temps de sacrifice : fin de la distraction (Jour 17) et mi-consolidation (Jour 34). Chaque groupe était sous-divisé en 3 sous-groupes représentant le type d'injection qui était administrée au site de distraction au jour 8. Pour chaque temps de sacrifice, 9 souris étaient injectées avec du PBS, 9 souris avec un Non-Target shRNA (NT) et 9 souris avec des lentivirus contenant Noggin et Chordin. Pour évaluer le succès notre infection, le shRNA qui visait Noggin fut transféré dans un plasmide contenant un marqueur GFP. Aussi, pour chaque sous-groupe, 6 échantillons étaient collectés pour une étude au Faxitron X-ray, μCT and immunohistochimie et 3 échantillons furent étudiés à l'aide du RT-PCR. Resultats: Sur les cultures de MC3T3-E1 non transfectées, les niveaux d'expression d'ARN pour Noggin et Chordin étaient à leur plus haut niveau au Jour 7. Au Jour 7, les études au RT-PCR ont aussi démontré que les lentivirus contenant les shRNAs les plus efficaces avaient créé une diminution des niveaux endogènes d'expression d'ARN de Noggin et Chordin à 10 et 17% respectivement comparés au contrôle. Les analyses de Western Blot ont aussi confirmé que ces mêmes shRNAs avaient réussi une diminution significative des protéines de Noggin et Chordin. Aussi, l'activité de l'alkaline phosphatase était augmentée par les cultures exprimant de façon stable les shRNAs visant Noggin et Chordin. Pour les études in vivo, toutes les chirurgies et les distraction furent réussies à l'exception de 2 morts suite à des complications chirurgicales. Toutefois, au moment de l'injection la majorité du contenu de l'injection However, at the time of the injection the majority of the injection ressortait du site d'injection. Une fois les échantillons collectés, les études Faxitron X-ray et μCT n'ont pas démontré de différence significative entre les 3 groupes dans le volume osseux ou le ration du volume osseux/volume tissulaire et ce, aux 2 temps de sacrifices. Finalement, les études en immunohistochimie furent arrêtées après qu'un marquage au GFP fut retrouvé dans les 3 groupes.Conclusion: Les analyses de Western blot analysis, qRT-PCR et les essais d' ALP assay sont en accord avec un knockdown réussi de Noggin et Chordin lors de notre étude in vitro. Lors de notre étude in vivo, les principaux problèmes rencontrés furent reliés à la technique de l'injection. Malheureuse, cette partie de notre étude n'a pas pu démontrer de différence significative dans la formation osseuse après l'utilisation d'injection de lentivirus contenant des shRNAs visant les antagonistes des BMPs Noggin et Chordin.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.116968 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Grenier-Vallée, Priscille |
| Contributors | C Reggie Hamdy (Internal/Supervisor), Pierre Moffatt (Internal/Cosupervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Surgery) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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