The claudin (Cldn) family of integral membrane proteins has roles in determining tight junction paracellular transport properties, formation and maintenance of epithelial cell layers, and morphogenesis. In the adult mouse kidney, claudin family members are expressed along the nephron and determine the specific paracellular transport properties of each nephron segment. The function of claudin proteins during kidney morphogenesis remains unclear. During kidney development, the ureteric bud emerges from the nephric duct and undergoes branching morphogenesis: the ureteric bud elongates and divides in a series of repeated bifurcations at the ureteric bud tips which ultimately give rise to the collecting ducts of the adult kidney. Based on the documented roles of claudins in organ morphogenesis and in renal physiology, we hypothesized that claudins are critical for kidney development and that perturbing their expression will lead to kidney malformations. To determine which claudins are expressed in the developing mouse kidney, RT-PCR analysis of embryonic day (E) 11.5 mouse kidneys was performed, and this revealed that 17 of the 25 members of the family were expressed. Cldn7, 16, and 19 are important for renal paracellular transport in the adult kidney. Cldn7 knockout mice die from dehydration during the first few weeks of life and Cldn16 and Cldn19 mutations result in renal magnesium and calcium wasting. Expression analysis of these claudins was performed during critical time points of mouse kidney development. By RT-PCR analysis, Cldn7 and Cldn19 were detected starting at E11.5, whereas Cldn16 was expressed starting from E13.5. Whole mount in situ hybridization showed that Cldn7 was expressed in the nephric duct at E9.5 and ureteric bud tips and stalks at later stages of kidney development whereas Claudin16 and Claudin19 were expressed at later stages of kidney development in tubular structures of E16.5 mouse kidneys. To examine if Claudin7 and Claudin16 mouse models have a defect in ureteric bud branching morphogenesis, nephron numbers were counted. In both models, no difference in nephron number compared to controls was found. This data suggest that other claudins expressed during kidney development might compensate for the loss of Cldn7 and Cldn16 such that the loss of these claudins does not lead to any renal morphological defects.We then examined if multiple claudins were critical for branching morphogenesis of the ureteric bud and if altering their expression would perturb kidney development. The C-terminus of Clostridium perfringens enterotoxin (C-CPE) binds to the second extracellular loop of Cldns 3, 4, 6, 7, 8, and 14, leading to their removal from tight junctions. By RT-PCR analysis, Cldn3, 4, 7, and 8 were detected at E11.5 onwards, Cldn6 was expressed at E11.5 to P1, and Cldn14 was expressed starting from E16.5 onwards. Using in situ hybridization analysis, Cldn3, 4, 6, 7, and 8 were expressed in the nephric duct and in the ureteric bud at E9.5 and E10.5 and in the ureteric bud tips and trunks at E13.5 and E16.5. Cldn14 was expressed only at E16.5 in late tubular structures. Removal of multiple claudins was performed by growing mouse embryonic kidney explants in the presence of C-CPE. A dose response curve was established by monitoring the formation of ureteric bud tips in explanted E11.5 and E12.5 kidneys cultured in a range of concentrations of C-CPE: 20µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml, and 500µg/ml. Based on quantitative analysis of ureteric bud tips of C-CPE and control E11.5 and E12.5 kidneys, the 200µg/ml dose was chosen as the standard dose for subsequent experiments. Then we confirmed our results by treating E12.5 explants with 200µg/ml C-CPE. C-CPE-treated kidneys did not differ in size from control kidneys but had decreased ureteric bud tip number and branching. In conclusion, our data suggest that claudins have a role in ureteric bud branching during kidney development. / La famille de protéines transmembranaire des Claudines (Cldn) joue un rôle dans l'établissement des propriétés de transports paracellulaires des jonctions serrées, dans la formation et dans le maintien des couches cellulaires épithéliales et dans la morphogénèse. Chez la souris adulte, les membres de la famille des Cldns sont exprimés le long du néphron et déterminent les propriétés spécifiques du transport paracellulaire de chaque segment du néphron. La fonction des Cldns durant la morphogénèse rénale reste à préciser. Durant le développement rénal, le bourgeon urétéral émerge du canal de Wolff et initie le processus de morphogénèse de ramification : le bourgeon urétéral subit une élongation, puis des ramifications successives à l'extrémité des différentes branches qui ultimement formeront le système collectif du rein adulte. Basé sur le rôle documenté des Cldns dans la morphogénèse et la physiologie rénale, nous soumettons l'hypothèse que les Cldns ont un rôle critique dans le développement rénal et que perturber leur expression entraîne des malformations rénales. Pour déterminer quelles Cldns sont exprimées durant le développement rénal murin, une analyse par RT-PCR de reins embryonnaires (E) de 11.5 jour a été effectuée. Cette expérience révèle que 17 des 25 membres de la famille sont exprimés. Les souris knock-out Cldn7 meurent de déshydratation durant leurs premières semaines de vie et des mutations de Cldn16 et Cldn19 résultent dans la perte de calcium et magnésium rénal. L'analyse de l'expression a été effectuée à des moments critiques du développement rénal. L'utilisation de la RT-PCR a permis de déterminer que l'expression de Cldn7 et Cldn19 commence à E11.5 et que celle de Cldn16 commence à E13.5. L'hybridation in situ sur tissu montre que Cldn7 est exprimée dans le canal de Wolff à E9.5 et à un stade ultérieur du développement dans les ampoules urétérales et dans les branches. Cldn16 et Cldn19 sont quant à elles exprimées au stade E16.5 dans des structures tubulaires. Pour déterminer si les souris Cldn7 et Cldn16 ont un défaut de morphogénèse de ramification, le nombre de néphron a été calculé. Dans les deux modèles, aucune différence n'a été observée entre les contrôles et les knockouts. Ces résultats suggèrent que d'autres Cldns exprimées durant le développement rénal peuvent compenser pour la perte de Cldn7 et Cldn16 expliquant que l'absence de ces Cldns n'entraîne aucun défaut dans la morphologie rénale. Nous avons donc examiné si de multiples Cldns jouent un rôle critique dans la ramification du bourgeon urétéral et si l'altération de leurs expressions perturbe le développement rénal. L'extrémité C-terminale de l'entérotoxine Clostridium perfringens (C-CPE) se lie à la seconde boucle extracellulaire des Cldns3, 4, 6, 7, 8 et 14 les enlevant par le fait même de la jonction serrée. La RT-PCR a permis de déterminer que Cldn3, 4, 6, 7 et 8 sont exprimées à partir d'E11.5. Cldn6 est exprimée entre E11.5 et P1 et Cldn14 est exprimée à partir d'E16.5. L'hybridation in situ montre que Cldn3, 4, 6, 7 et 8 sont exprimées dans le canal de Wolff et dans le bourgeon urétéral à E9.5 et E10.5. Aux stades E13.5 et E16.5, elles sont exprimées dans les ampoules urétérales et dans les branchements. Cldn14 est exprimée uniquement à E16.5 dans les structures tubulaires matures. Des explants de reins E11.5 et E12.5 ont été cultivés en absence ou présence de C-CPE (20µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml et 500µg/ml). Basé sur une analyse quantitative du nombre d'ampoules urétérales, la dose de 200µg/ml a été choisie comme standard. Nous avons confirmé nos résultats en traitant les explants d'E12.5 avec 200µg/ml de C-CPE. La taille des reins traités avec le C-CPE ne diffèrent pas de celle des contrôles, mais le nombre d'ampoules urétérales et de ramification est inférieur. En conclusion, nos résultats suggèrent que les Cldns jouent un rôle dans la ramification du bourgeon urétéral durant le développement rénal.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.117156 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Khairallah, Halim |
| Contributors | Aimee Ryan (Internal/Supervisor), Indra Gupta (Internal/Cosupervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Human Genetics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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