Recent studies indicate that children conceived using assisted reproductive technologies are at increased risk of growth disorders and genomic imprinting diseases. Reports have suggested that these disorders could result from epimutations including abnormal DNA methylation patterns in imprinted genes. DNA methylation, catalyzed by a family of DNA methyltransferases (DNMTs), is both heritable and reversible and is the major epigenetic mark associated with imprinting. We propose that techniques used in ART, such as ovarian stimulation, and factors underlying infertility might interact to disrupt DNA methylation. In this study, we investigated whether superovulation in combination with DNMT1o deficiency could induce more severe perturbations of imprinted methylation in mouse blastocysts, than ovarian stimulation alone. Female mice heterozygous for lack of oocyte-derived DNMT1o and Dnmt1o +/+ controls were subjected to moderate (6.25 IU PMSG/hCG) or high (10 IU PMSG/hCG) hormone doses and then mated with B6 (CAST7) males. At 3.5 days, ovulation sites were counted and blastocysts were collected. Methylation patterns of the imprinted genes Snrpn, H19 and Kcnq1ot1 were assessed by bisulfite sequencing from pools of 5 to 8 blastocysts. The high hormonal dose induced higher ovulation rates but also the lowest yield of blastocysts. The moderate and high doses were selected for the DNA methylation analysis. DNMT1o deficiency did not significantly perturb Snrpn methylation patterns in blastocysts of females injected with the moderate dose of hormones. H19 methylation patterns were more susceptible to perturbation, showing a preliminary indication of a slight gain of methylation on the maternal allele after superovulation at the moderate and high doses. The high dosage regimen showed evidence of perturbed Kcnq1ot1 methylation patterns in one of the pools of blastocysts with the paternal allele showing an unexpected gain of methylation. Follow-up studies will be conducted by transferring blastocysts into pseudopregnant females and examining the effects at later times in development (i.e. mid-gestation). The aim will be to determine whether superovulation and DNMT1o-deficiency are associated with abnormalities in genomic imprinting in postimplantation development. / Des études récentes indiquent que les enfants conçus à l'aide de procréation médicalement assistée (PMA) sont à risque accru de troubles de la croissance et de maladies à empreinte génomique. Des rapports ont suggéré que ces troubles pourraient résulter d'épimutations anormales au niveau de la méthylation de l'ADN dans les gènes imprimés. La méthylation de l'ADN, catalysée par une famille d'ADN méthyltransférases (DNMTs), est la principale marque épigénétique associée à l'empreinte. Nous proposons que les techniques utilisées dans le cadre de la reproduction assistée, telles que la stimulation ovarienne, et l'infertilité pourraient interagir de manière à perturber la méthylation de l'ADN. Dans cette étude, nous avons examiné dans quelle mesure la superovulation jumelée avec un déficit au niveau de la DNMT1o pourrait induire davantage de perturbations graves de la méthylation dans les blastocystes de souris, que la stimulation ovarienne seule. Des souris femelles hétérozygotes pour le manque d'ovocyte dérivé DNMT1o et les contrôles ont été soumis à une stimulation de l'ovaire à dose modérée (6,25 UI de PMSG / HCG) ou élevée (10 UI de PMSG / hCG) d'hormones et puis accouplées avec des mâles B6 (CAST7). À 3,5 jours, les sites d'ovulation ont été comptés et blastocystes recueillis. Les profils de méthylation des gènes à empreinte génétique Snrpn, H19 ainsi que Kcnq1ot1 ont été évalués à l'aide du séquençage au bisulfite à partir d'un pool de 5 à 8 blastocystes. La dose élevée hormonale induit des taux d'ovulation élevés, mais aussi le plus faible rendement de blastocystes. Nous avons sélectionné les doses modérées et élevées pour l'analyse de la méthylation d'ADN. La carence en DNMT1o n'a pas perturbé de manière significative les profils de méthylation dans le gène Snrpn au sein de blastocystes de femelles injectées avec la dose modérée d'hormones. Les profils de méthylation de H19 ont été plus sensibles aux perturbations, révélant une hyperméthylation sur l'allèle maternel après superovulation à la dose modérée et élevée. Le dosage élevé induit une plus grande perturbation des profils de méthylation de Kcnq1ot1 dans l'un des pools: l'allèle paternel a arboré un gain surprenant de méthylation.D'autres études seront menées en effectuant un transfert de blastocystes chez des femelles pseudo-enceintes plus tard dans le développement (c'est-à-dire à mi- gestation), afin de déterminer si la combinaison de la superovulation et de la carence en DNMT1o est associée à des anomalies dans les gènes à empreinte génétique après l'implantation de l'embryon.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119651 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Ghorayeb, Yasmine |
| Contributors | Jacquetta M Trasler (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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