Bril is a 134 amino acid-long protein compartmentalized exclusively on the osteoblast cell surface, with two transmembrane domains. Its osteoblast-specific expression coincides with the onset of bone matrix formation and mineralization and has been shown to have an essential role in bone mineralization in vitro, although the mechanism involved is still unknown. The purpose of this study was to characterize the regulation pattern of the Bril gene by identifying the cis-elements on the promoter and the transcription factors that modulate its activation. The promoter for the mouse, rat, and human Bril gene were independently cloned into a luciferase (Luc) reporter plasmid. Transient transfection studies were then performed to compare the activity of the Luc reporter in permissive (UMR106, MC3T3-E1) and non-expressing cell lines (HEK293). Deletion mutant analyses revealed that the proximal 300bp promoter was sufficient to confer highest activation in the three species studied. In silico analysis, EMSA and DNAseI footprinting studies revealed that this region is rich in GC-boxes and contains many potential regulatory elements known to be involved in osteoblastic differentiation (e.g. Runx2, TCF1/LEF, Osx/Sp7/Sp1) that are fully functional. Co-transfection experiments in HEK293 and MC3T3-E1 cells showed that the Bril promoter is most strongly trans-activated by forced expression of Sp1 and the long variant of Sp3, moderately by members of the Wnt pathway (i.e. β-catenin and TCF/LEF), yet is not considerably affected by bone-specific factors. Additionally, shRNA-mediated knockdown of Sp1 (but not Sp3) in UMR106 cells resulted in complete abrogation of Bril protein. In vitro interference of the GC-rich boxes via GC-bisintercalating agents and CpG methylation resulted in a dramatic drop in Bril promoter activity; which highlights the importance of these GC-sequences in promoting Bril regulation. In a search for molecules that might regulate Bril expression, the parathyroid hormone (PTH) was found to be a potent negative regulator. Endogenous Bril expression in UMR106 was dramatically downregulated by PTH in a time- and dose-dependent manner, which coincided with suppressed osteoblast mineralization. These results provide the first mechanistic evidence for regulation of the Bril gene, which could help situate its function in the bone mineralization process in vitro. / Bril est une protéine de 134 acides aminés, localisée exclusivement sur la membrane des ostéoblastes avec deux domaines transmembranaires. Son expression exclusive dans les ostéoblastes coïncide avec le début de la formation osseuse et la minéralisation de la matrice. Ainsi, un rôle essentiel a été démontré dans la minéralisation osseuse in vitro, bien que le mécanisme en cause n'est pas encore connu. L'objectif de cette étude était de caractériser le mode de régulation du gène Bril en identifiant les éléments cis sur le promoteur et les facteurs de transcription qui modulent son activation. Le promoteur du gène Bril de la souris, du rat et de l'homme ont été indépendamment clonés dans un plasmide rapporteur de la luciférase (Luc). Des transfections transitoires ont ensuite été effectuées pour comparer l'activité Luc dans des cellules qui expriment (UMR106, MC3T3-E1) ou non (HEK293) le gène Bril de manière constitutive. L'analyse des mutants de délétion a révélé que le promoteur proximal 300 pb est suffisant pour conférer la majorité d'activation dans les trois espèces étudiées. Ainsi, les analyses in silico ont révélé que cette région est riche en séquences de GC et contient des éléments de régulation putatifs connus pour être impliqués dans la différenciation ostéoblastique (par exemple Runx2, TCF1/LEF, Osterix ou Sp1). Des analyses de retard sur gel (EMSA) et de cartographie à la DNAseI ont indiqué que beaucoup d'entre eux sont des sites fonctionnels. Les co-transféctions dans des cellules HEK293 et MC3T3-E1 ont montré que le promoteur Bril est le plus fortement trans-activé par l'expression forcée de Sp1 et la variante longue du Sp3, modérément par des membres de la voie Wnt (β-caténine et TCF /LEF), mais ne sont pas encore fortement influencés par des facteurs spécifiques à l'os. En plus, l'invalidation dans les cellules UMR106 de Sp1 (et non Sp3) par les shRNAs mène à l'abrogation complète de la protéine Bril. In vitro, l'interférence des séquences GC (via les drogues MMA et WP631 et la méthylation) a entraîné une forte baisse de l'activité promoteur de Bril; ce qui souligne l'importance de ces GC-séquences dans la promotion et la réglementation du Bril et propose la méthylation de l'ADN comme un mécanisme à considérer dans la spécificité d'expression cellulaire de Bril. La recherche de molécules qui pourraient réguler l'expression de Bril a identifié l'hormone parathyroïde (PTH) comme un puissant régulateur négatif. L'expression endogène de Bril dans les UMR106 a été considérablement diminuée par la PTH dans une manière dose-dépendante, qui coïncide avec une reduction de la minéralisation des ostéoblastes. Ces résultats fournissent les premières preuves d'un mécanisme pour la régulation du gène Bril, qui pourrait aider à démontrer sa fonction dans le processus de minéralisation osseuse in vitro.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.103567 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Kasaai, Bahar |
| Contributors | Pierre Moffatt (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Human Genetics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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