Epithelial ovarian cancer (EOC) is frequently diagnosed at advanced stage, which is associated with poor outcome. The etiology of this disease is largely unknown, hindering the development of effective disease detection strategies and treatment options. Cytogenetic and molecular genetic analyses have frequently reported chromosome 17 anomalies in EOC. Loss of heterozygosity (LOH) analyses have found loss of chromosome 17 often involving an entire chromosome 17 homologue, as well as recurrent patterns of LOH of specific regions of chromosome 17, such as 17q25. Based on Alfred G. Knudson's "two-hit model" and the paradigm of the classical tumour suppressor gene (TSG), LOH may be indicative of a TSG-containing genomic region. The hypothesis of this thesis research states that there exist as yet unidentified TSGs mapping to chromosome 17 that contribute to EOC tumourigenesis. LOH analysis was performed to refine a previously identified minimal region of deletion (MRD) at 17q25 and identify TSG candidates. Refinement of the MRD to a 65 Kb interval found three candidate genes that mapped to this region. Gene expression analysis of the candidate genes found RHBDF2 and CYGB to be underexpressed in EOC samples, relative to primary cultures of normal ovarian surface epithelial cells (NOSE) samples. These two candidate genes were investigated for DNA sequence mutations and evidence of promoter methylation, which are classical mechanisms of TSG inactivation. No mutations were identified in either gene, however evidence of promoter methylation was found for CYGB. Thus based on their expression profiles, and in the case of CYGB, evidence of promoter methylation, both RHBDF2 and CYGB have emerged as TSG candidates in EOC warranting further investigation to test their TSG candidacy. An alternate approach for identifying regions of LOH, whole-genome genotyping analysis using single nucleotide polymorphism (SNP) arrays, was performed on high-grade ovarian serous carcinoma (HGOSC) samples to characterize the genomic content of these samples. In that analysis LOH of the entirety of chromosome 17 was observed in nearly 100% of samples analysed, suggesting that LOH of this chromosome is a near-ubiquitous feature of these cancers. Gene expression microarray analysis was performed to identify chromosome 17 genes that are differentially expressed in HGOSC samples relative to the primary cultures of NOSE samples. This analysis found 253 differentially expressed genes, where five genes, ADORA2B, CCL2, ACLY, WIPI1, and SLC16A3, were found underexpressed at least three-fold in all HGOSC samples analysed, relative to the primary cultures of NOSE samples. Underexpression may be indicative of an inactivated TSG, thus a "functional" complementation approach was used to test whether "re-expressing" one of these five genes would suppress tumourigenicity. An expression vector containing the coding region of CCL2 was transfected into the tumourigenic EOC cell line OV-90, which does not express CCL2, to generate stable CCL2-expressing clones. Injection of the CCL2¬-expressing clones into SCID mouse xenograft tumour models resulted in increased tumour latency and increased survival, relative to mice injected with the parental cell line. Thus expression of CCL2 appears to contribute to increased tumour latency, suggesting that this gene contributes to inhibiting tumourigenesis. This thesis research found that chromosome 17 loss and underexpression of chromosome 17 genes is common in HGOSC, suggesting that several chromosome 17 genes may be involved in TSG pathways, and that the genes RHBDF2, CYGB and CCL2 are candidate TSGs warranting further investigation in EOC. / Le cancer épithélial de l'ovaire (CEO) est fréquemment diagnostiqué à un stade avancé de la maladie ce qui l'associe à une issue défavorable. L'étiologie de la maladie reste en grande partie inconnue, ce qui nuit au développement de stratégies de dépistage efficaces ainsi qu'au développement de nouveaux traitements. Le chromosome 17 présente de fréquentes anomalies dans les CEO. Des analyses de pertes d'hétérozygotie (LOH) ont mis en évidence la perte allélique de régions spécifiques du chromosome 17 et même la perte du chromosome 17 dans son intégralité. Selon la théorie des deux évènements de Alfred G. Knudson et le paradigme des gènes suppresseurs de tumeurs (TSG) classiques, ces LOH présentes sur le chromosome 17 suggèrent la présence de régions abritant des TSG. Ce travail de thèse se base sur l'hypothèse qu'il existe au moins un TSG, encore non identifié, localisé sur le chromosome 17 qui contribuerait à l'initiation ou au développement du CEO. Une analyse LOH a été effectuée pour affiner la cartographie d'une région minimale de délétion (RMD), déjà déterminée dans la région 17q25, et identifier de nouveaux TSG. L'affinement des frontières de la RMD a réduit à 65 Kb l'intervalle et a identifié trois gènes candidats. L'analyse de l'expression de ces gènes a montré une répression transcriptionnelle de RHBDF2 et de CYGB dans des échantillons de CEO, comparativement à des cultures primaires ce cellules épithéliales de l'ovaire normal (EON). Ces deux gènes candidats ont fait l'objet d'analyses génétiques pour la détection des mécanismes classiques d'inactivation des TSG. Aucune mutation ne fut trouvée dans ces deux gènes, en revanche, le promoteur de CYGB est apparu méthylé. En s'appuyant sur leurs profils d'expression génique, et dans le cas de CYGB, sur la méthylation du promoteur, RHBDF2 and CYGB apparaissent comme de sérieux candidats. Une approche alternative pour identifier les régions présentant des LOH, le génotypage à l'échelle du génome entier par puces à marqueurs SNP (Polymorphismes à Simple Nucléotide), a été utilisée sur des d'échantillons de carcinomes ovariens séreux de haut grade (COSHG) pour caractériser leur contenu génomique. Les résultats montrent qu'une LOH du chromosome 17 dans son intégralité est observée dans 100% des cas analysés, suggérant que le LOH pour ce chromosome est ubiquitaire dans ce type de cancer. L'analyse de l'expression génique par puce à ADN a été effectuée pour identifier les gènes du chromosome 17 qui sont différentiellement exprimés dans les COSHG, comparativement aux EON. Cette analyse a révélé 253 gènes différentiellement exprimés, et parmi eux, ADORA2B, CCL2, ACLY, WIPI1, et SLC16A3, ont été trouvés transcriptionnellement réprimés dans tous les COSHG. Cette répression transcriptionnelle pouvant indiquer l'inactivation d'un TSG. Une approche fonctionnelle de complémentation a été utilisée pour tester si la réexpression d'un des ces gènes pourrait supprimer la tumorigénicité dans les COSHG. Un vecteur d'expression contenant la région codante du CCL2 a été transfecté dans OV-90, une lignée cellulaire de CEO qui n'exprime pas CCL2, afin de générer des clones stables exprimant CCL2. L'injection de ces clones dans des souris SCID a montré une latence dans la formation de tumeurs et une prolongation de la survie des souris, comparativement à celles injectées avec OV-90. L'expression de CCL2 semble donc induire une latence dans la formation tumorale, ce qui suggère que ce gène participe à l'inhibition de la tumorigénèse. Ce travail de thèse a montré que la perte allélique du chromosome 17 ainsi que la répression transcriptionnelle des gènes du chromosome 17 sont des évènements fréquents dans les COSHG. Les résultats obtenus suggèrent que plusieurs gènes sur ce chromosome pourraient être impliqués dans la tumorigénèse ovarienne, et que RHBDF2, CYGB et CCL2 sont de candidats pour être des TSG, méritant de faire l'objet d'analyses plus approfondies sur leurs fonctions dans les CEO.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110350 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Wojnarowicz, Paulina Maria |
| Contributors | Patricia N Tonin (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Human Genetics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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