The retinoblastoma tumour suppressor, Rb, is a cell cycle regulator that acts to prevent the progression from G1 to S-phase. Rb regulates this transition by inhibiting E2F family transcription factors which control the expression of genes required for the G1 –S phase progression. Consequently, mutations in rbf1, the Drosophila homologue of the Rb tumour suppressor gene, generate defects in cell cycle control. In an effort to identify genes regulated by the EGFR/ras pathway that co-operate with mutations of rbf1 we singled out a gene called Capicua, an HMG box transcription factor that regulates growth in Drosophila. In Drosophila eye imaginal discs cic mutations co-operate with rbf1 to reduce levels of cell death and increase ectopic S-phase entry. The goal of this thesis was to characterize the co-operative effect of rbf1 and cic, and to determine whether this synergy proves to be conserved in the mammalian system. In clones of cells mutant for cic in either an rbf1 hypomorphic background or a wild-type background we observed decreased levels of reactive oxygen species (ROS), which suggests that cic is required for ROS homeostasis. Furthermore, by modulating levels of ROS scavenger enzymes, such as superoxide dismutase 2 (SOD2), we found that we could modulate the characteristic cell death phenotype observed in rbf1 mutant eye discs. Thus, we propose that changes in ROS levels through cic mutations might contribute to their pro-survival effect. Through further analysis of rbf1 eye discs carrying cic mutations we discovered that levels of cyclin E are increased. This result suggests that the ability of rbf1 and cic to promote G1 arrest may be mediated by limiting cyclin E expression. To address whether CIC mutation affects proliferation and survival in the mammalian system, an shRNA construct was used to knockdown CIC protein levels in triple knockout mouse embryonic fibroblasts (TKO MEFS), which are knockout for all three Rb family proteins. Comparison of CIC knockdown cell lines to controls via western blotting for PARP and C3, as well as flow cytometric analysis, revealed that CIC knockdown suppresses the cell death phenotype of TKO MEFs. Moreover, 2D cell cycle analysis by co-staining with BrdU and PI revealed that CIC knockdown cell lines have an elevated percentage of cells in S phase of the cell cycle. The results from these knockdown cell lines suggest that the ability of CIC to affect cell death and cell cycle control of RB-deficient cells is conserved in mammals. / Le suppresseur de tumeurs Rétinoblastome, Rb, est un régulateur du cycle cellulaire qui empêche la transition par G1 à la phase-S. Rb régule ce passage par inhiber les facteurs de transcription E2F qui contrôlent l'expression des gènes requis pour le passage de la phase G1 à la phase S. Par conséquent, les mutations en rbf1, l'homologue du suppresseur de tumeur Rb dans les Drosophiles, créent des défauts dans le cycle cellulaire. En un effort d'identifier les gènes réguler par la cascade EGFR/ras qui coopèrent avec les mutations en rbf1, nous avons distingué un gène nommé Capicua, un facteur de transcription que régule la croissance en Drosophile. Dans les disques imaginaux des yeux des Drosophiles les mutations cic coopèrent avec rbf1 pour réduire les niveaux de mort cellulaire et pour augmenter l'entrée en phase ectopique S. Le but de ma thèse était de caractériser l'éffet coopératif de rbf1 et cic et aussi de déterminer si la relation de synergie est conservée au système mammalien. Dans les clones de cellules mutants pour cic au profil où rbf1 est déficient et dans le profil de type sauvage nous avons observé une réduction des dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) qui suggère que cic est requis pour la homéostasie de DRO. De plus, en modulant les niveaux des enzymes de fixateur de DRO comme superoxide dismutase 2 (SOD2), nous avons trouvé que nous avons été capable de moduler le phénotype de mort cellulaire observé aux disques des yeux où rbf1 est muté. Par conséquent nous proposons que les changements aux niveaux de DRO provoqué par les mutations de cic peuvent contribuer à l'effet contre la mort cellulaire. Par plus loin analyser des disques imaginaux des yeux rbf1 avec les mutations de cic nous avons découvert que les niveaux de cyclin E sont augmentés. Ce résultat suggère que la capacité de rbf1 et cic d'encourager l'arrêt du cycle cellulaire G1 est peut-être parce que ces facteurs contrôlent l'expression de cyclin E. Pour nous nous intéressons si la mutation de cic a un effet sur la survie où la prolifération des cellules au système mammalien j'ai utilisé un shRDA pour baisser les niveaux de la protèine dans les fibroblastes de souris embryonnaires triple knockout (TKO MEFs), qui sont knockout pour les trois protèines de la famille Rb. Nous avons comparé les lignées cellulaires CIC knockdown aux contrôles par immunotransfert pour PARP et C3 ainsi que la cytométrie de flux ont révélé que le knockdown de CIC régule negativement la phenotype de TKO MEFs. De plus, l'analyse bidimensionelle du cycle cellulaire par co-tache avec BrdU et PI a révélé que les lignées cellulaires avec knockdown de CIC a un pourcentage élevé de cellules en phase-S de la cycle cellulaire. Les résultats de ces lignées cellulaires knockdown suggèrent que l'effet de CIC sur la mort cellulaire et la contrôle du cycle cellulaire des cellules deficientes en RB est conservé aux mammifières.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.121335 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Krivy, Kate |
| Contributors | Nam Sung Moon (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses |
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