Abstract:The 90-kb androgen receptor (AR) gene is located at locus Xq11-12 and has eight exons that encode a protein of about 919 amino acids. Exon 1 encodes the transactivational domain, exons 2 and 3 encode the DNA-binding domain, and exons 4 through 8 encode the ligand-binding domain. The AR protein, a nuclear receptor that belongs to the steroid/thyroid hormone receptor family, functions primarily as a DNA-binding transcription factor to regulate gene expression. The AR also has a role in the development of the male phenotype: in fact, cytoplasmic AR is activated by binding testosterone or dihydrotestosterone hormone before translocating to the nucleus. Spinal and Bulbar Muscular Atrophy (SBMA), also known as Kennedy's disease, is an X-linked recessive neurodegenerative disease. The cause of SBMA is expansion of the CAG trinucleotide repeat, which codes for glutamine (Gln, Q), in Exon 1 of the AR gene. Therefore SBMA is considered to be a polyglutamine (polyGln) expansion disorder. In unaffected men, 9-33 CAG repeats coding for Gln are found, while males who inherit more than 37 CAG repeats will develop SBMA. The toxic gain of AR function that is characteristic of SBMA results in a slow progressive muscle weakness, atrophy of the tongue, fasciculations of bulbar, facial and limb muscles, and muscle cramping. A loss of AR function is related to breast enlargement and reduced fertility.The ubiquitin-proteasome system (UPS), which functions in protein degradation, plays an important role in neural cells from SBMA patients. UPS components are found in polyGln-expanded protein aggregates seen in these cells. Therefore previous studies have suggested that the UPS is impaired in SBMA. Previous work suggests that 0QAR and 20QAR can be degraded via the UPS, however, the 50QAR appeared to inhibit the degradation of specific proteins by the UPS. It is also hypothesized that these SBMA-inducing mutant ARs can accumulate in the cell and cause disease by evading UPS degradation. The primary goal of this research was to develop a system for ubiquitinating AR by using an expressed protein ligation (EPL) system. To prove this hypothesis, several intermediate goals have been achieved. PCR-amplified fragments of AR (0Q, 20Q, and 50Q) were cloned into the pTWIN2 vector and contructs were analyzed using restriction enzyme digests and gel electrophoresis. Furthermore, 0QAR, 20QAR, 50QAR and human ubiquitin (HUB) fusion proteins were purified using chitin beads and cleaved using 2-mercapto-ethanesulfonic acid (MESNA). Finally, the 0QAR, 20QAR, 50QAR peptides were ligated with an HA-tagged H2B peptide using EPL. Thus, we successfully developed tools which can be used to explore ubiquitinatination of the AR using EPL systems in vitro. Future work aims to ligate the HUB protein to a peptide to using the EPL method, and then ligating the ubiquitinated peptide to the three different AR peptides. These will be added to active proteasomes to explore the involvement of the UPS in the pathogenesis of SBMA. / Abrégé:Le gène de 90-kb du récepteur androgène (AR) est localisé au locus Xq11-12 et possède huit exons codant pour une protéine d'environ 919 acides aminés. L'exon 1 code pour le domaine transactivationnel, les exons 2 et 3 codent pour le domaine de liaison à l'ADN, et les exons 4 à 8 codent pour le domaine de liaison au ligand. La protéine du AR, un récepteur nucléaire appartenant à la famille des récepteurs hormonaux stéroïdiens/thyroïdiens, agit primordialement en tant que facteur transcriptionnel se liant à l'ADN pour réguler l'expression génique. Le AR possède également un rôle dans le développement du phénotype masculin: en effet, le AR cytoplasmique est activé en se liant aux hormones testostérone ou dihydrotestostérone avant de se translocaliser au noyau.L'amyotrophie bulbo-spinale (SBMA-Spinal and Bulbar Muscular Atrophy), aussi connue sous le nom de maladie de Kennedy, est une maladie neurodégénérative liée au chromosome X récessif. La cause de la SBMA est une expansion du triplet CAG répété, lequel code pour une glutamine (Gln,Q), dans l'exon 1 du gène AR. Ainsi, la SBMA est considérée comme étant un désordre d'expansion polyglutaminique (poly-Gln). Chez l'homme non-affecté, on retrouve 9-33 répétitions CAG codant pour la Gln, alors que l'homme qui hérite plus de 37 répétitions CAG développera la SBMA. Le gain de fonction toxique du AR caractérisant la SBMA se traduit par: une faiblesse musculaire à progression lente, une atrophie de la langue, des fasciculations des muscles bulbaires, faciaux et limbiques et enfin par des crampes musculaires. Une perte de fonction du AR est liée à l'élargissement de la poitrine et à la fertilité réduite.Le système ubiquitine-protéasome (UPS), responsable dans la dégradation protéique, joue un rôle important dans les cellules neurales chez les patients atteints de la SBMA. Les composantes de l'UPS se trouvent dans les aggrégats protéiques de l'expansion poly-Gln dans ces cellules. C'est la raison pour laquelle des études précédentes ont suggéré que l'UPS est affaibli dans la SBMA. D'autres études antérieures suggèrent que les peptides 0QAR et 20QAR peuvent être dégradés par l'UPS, cependant le peptide 50QAR semble inhiber la dégradation par lUPS de certaines protéines spécifiques. L'hypothèse veut que ces mutants AR responsables de la SBMA peuvent s'accumuler dans la cellule et causer la maladie en s'évadant de la dégradation UPS. Le but premier de ce projet était de développer un système d'ubiquitination du AR en appliquant le système de ligation des protéines exprimées (expressed protein ligation-EPL). Afin de prouver cette hypothèse, quelques buts intermédiaires ont été atteints. Les fragments du AR (0Q, 20Q, et 50Q), amplifiés par PCR, ont été clonés dans le vecteur pTWIN2 et les clones ont été analysés sur gels d'électrophorèse suite aux digestions par enzymes de restriction. De plus, les fragments 0QAR, 20QAR et 50QAR ainsi que les protéines de fusion de l'ubiquitine humaine (HUB) ont été purifiés à l'aide de billes de chitine et clivés par l'acide mercapto-2-éthanesulfonique (MESNA).Les peptides 0QAR, 20QAR et 50QAR ont été unis par ligation au peptide de fusion H2B doté d'un tag HA en se servant du système EPL. Ainsi, nous avons développé avec succès des outils permettant d'explorer l'ubiquitination du AR en utilisant les systèmes EPL in vitro. Des expériences à l'avenir viseront à lier par ligation la protéine HUB à un peptide, en utilisant la méthode EPL et ensuite faire la ligation du peptide ubiquitiné aux trois différents peptides AR. Ces derniers seront ajoutés aux protéasomes actifs pour explorer l'implication de l'UPS dans la pathogénèse de la SBMA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.121439 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Mokhtar, Shaza |
| Contributors | Lenore Beitel (Internal/Cosupervisor2), Mark Anthony Trifiro (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Human Genetics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses |
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