Retinoblastoma, Rb, tumor suppressor protein is a cell cycle regulator preventing transition from G1 to S phase. Rb also regulates various biological processes during development and tumorigenesis. While the molecular mechanism by which pRb controls cell cycle progression is well characterized, how pRb promotes cell-type specification and differentiation is less understood. A genetic overexpression screen searching for factors cooperating with mutations in rbf1, the Drosophila homologue of Rb, lead to the identification of emc, extramacrochaetae, whose mammalian homologue Id2 has a known role in pRb-deficient tumorigenesis. The goal of my project is to understand the role of rbf1 in development and differentiation through a study of the genetic interaction between rbf1 and emc. In my thesis, I have demonstrated that RBF1 deficiency during Drosophila melanogaster eye development deregulates EMC, causing defects in the development of photoreceptors and cone cells; consequently, I have shown EMC is an important protein contributing to the developmental defects caused by RBF1 deficiency. My first aim is to characterize the defects associated with emc overexpression in rbf1 mutant background as well as the intrinsic defects associated with the rbf1 mutant background. I found that EMC overexpression in rbf1 hypomorphic eye imaginal discs of third instar Drosophila larvae, induces cone cell and photoreceptor, two types of eye-specific cells, defects while having no such effects in the wild-type background. Examination of the differentiating photoreceptors, indicated that EMC overexpression interferes with photoreceptors that are specified at later stages of Drosophila eye development, specifically in the rbf1 mutant background. Furthermore, given the role of RBF1 as a transcriptional repressor, I examined the effect of RBF1 on EMC level and discovered that, in rbf1 null clones, EMC was upregulated, in particular, within the photoreceptors. I then proceeded to characterize the photoreceptor clusters and discovered that more than one third of the rbf1 null ommatidia exhibit similar cone cell and photoreceptor defects in the absence of ectopic EMC expression.My next aim was to elucidate the mechanism of the interaction between rbf1 and emc. To test for conservation of the physical interaction demonstrated in mammals in Drosophila, I tested for an interaction between EMC and RBF1 but no conservation was observed either in S2 cells or in vivo. Moreover, I determined the level of regulation of EMC by RBF1 is post-transcriptional and can be ubiquitin-dependent. To be able to follow EMC protein, I generated a transgenic fly line carrying a GFP tagged EMC which I used to observe that RBF1 suppresses expression of ectopic EMC protein in photoreceptors. This could explain the synergistic effect between EMC overexpression and rbf1 mutations, as well as the developmental defect observed in rbf1 null ommatidia. In summary, EMC cooperates with RBF1 in Drosophila eye development and is post-transcriptionally regulated. My findings demonstrate that ID family proteins are an evolutionarily conserved determinant of pRb deficient cells, playing an important function during development. / Le suppresseur de tumeurs Rétinoblastome, Rb, est une protéine régulatrice du cycle cellulaire qui empêche le passage de la cellule de la phase G1 à la phase S. En même temps, Rb est aussi un régulateur de plusieurs processus biologiques durant le développement normal et la tumorigénèse. Même si le mécanisme moléculaire utilisé par Rb pour contrôler la progression du cycle cellulaire est bien connu, le processus par lequel Rb promouvoit la spécification cellulaire et la différentiation est moins bien comprise. Un criblage génétique de surexpression cherchant des facteurs qui coopèrent avec des mutations de rbf1, l'homologue de Rb pour Drosophila, a mené à l'identification de emc, extramacrochaetae, dont l'homologue mammifère Id2 a un rôle bien connu dans la tumorigénèse en l'absence de Rb. Le but général de mon projet est de comprendre le rôle de Rb dans le développement et la différentiation à travers une étude de l'interaction génétique entre rbf1 et emc. Dans ma thèse, j'ai démontré que l'absence de Rb pendant le développement de l'œil de Drosophila melanogaster dérégule EMC, ce qui cause des défauts dans le développement des cellules photoréceptrices et des cônes; en conséquence, j'ai confirmé qu'EMC est une protéine importante qui contribue aux défauts développementaux causés par la déficience de Rb. Mon premier objectif est de caractériser les défauts associés à la surexpression de emc en absence de rbf1 et aussi de caractériser les défauts intrinsèques associés au profil où rbf1 est déficient. J'ai trouvé que la surexpression de EMC dans les disques imaginaires oculaires de larves de drosophiles au troisième stade possédant une forme hypomorphe de rbf1 mène aux défauts dans les photorécepteurs et dans les cônes, deux types de cellules oculaires spécifiques, mais ne mène pas à des effets similaires dans le profil de type sauvage. Mes études des cellules photoréceptrices en différentiation indiquent que la surexpression d'emc interfère avec le développement des photorécepteurs spécifiés tard dans le développement oculaire de Drosophila, en particulier dans le profil ou rbf1 est muté. De plus, connaissant le rôle de RBF1 en tant que répresseur transcriptionnel, j'ai examiné l'effet de RBF1 sur les niveaux de la protéine EMC et j'ai découvert que, dans les clones nuls pour rbf1, EMC était régulé positivement, en particulier dans les cellules photoréceptrices. Ensuite, j'ai caractérisé les ensembles de cellules photoréceptrices et j'ai découvert que plus d'un tiers des ommatidia nuls pour rbf1 présentent des photorécepteurs et des cônes ayant des défauts développementaux en l'absence de la surexpression ectopique d'EMC.Mon deuxième objectif est d'élucider le mécanisme d'interaction entre rbf1 et emc. Chez les mammifères, il y a une interaction physique observée entre pRb et ID2. Afin de tester la conservation de cette interaction physique dans Drosophila, j'ai examiné l'interaction entre RBF1 et EMC, mais je n'ai pas observé de conservation de cette interaction ni dans les cellules S2, ni in vivo. D'ailleurs, j'ai déterminé que la régulation de EMC par RBF1 est au niveau post-transcriptionnel et qu'il peut dépendre de l'ubiquitin. Dans le but d'être capable de suivre la protéine EMC ectopique, j'ai produit une ligne de mouches transgéniques portant GFP-EMC. J'ai utilisé cette ligne pour observer que RBF1 régule négativement l'expression de la protéine EMC ectopique dans les photorécepteurs. Ceci pourrait expliquer l'effet synergique entre la surexpression d'EMC et les mutations de rbf1 ainsi que les défauts développementaux observés dans les ommatidia déficientes pour rbf1. En résumé, EMC coopère avec RBF1 dans le développement de l'œil de Drosophila et est régulé de manière post-transcriptionnelle. Mes découvertes démontrent que les protéines de la famille ID sont un déterminant des cellules dans lesquelles Rb est absent qui est conservé évolutionnairement et qui possède une fonction importante durant le développement.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110536 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Popova, Milena Kamenova |
| Contributors | Nam Sung Moon (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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