Congenital anomalies of the kidney and urinary tract (CAKUT) are the most common cause of chronic kidney disease in infants. CAKUT includes a spectrum of urinary tract anomalies that can be found alone or in combination, such as vesicoureteral reflux, and duplex kidneys. Murine models of these defects have been instrumental in identifying novel genetic regulators of both normal and aberrant kidney development. In mammals, kidney formation proceeds through three phases; pro-, meso- and metanephric development. Gene inactivation studies have identified essential regulators at each stage of normal kidney development. Specifically, the individual roles of transcription factors (TFs) Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 and Evi1 in urogenital system development have been described by our lab and others. Here we explore the genetic network of interactions and cooperativity between these TFs in the context of normal and aberrant urogenital system (UGS) development. In order to establish a genetic transcriptional hierarchy between Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 and Evi1, we investigated the expression of these TFs, as well as selected downstream developmental effectors, in each homozygous mutant embryo. In addition, we performed microarray analyses on the mesonephros of Pax2 and Gata3 mutant embryos, establishing their genetic expression profiles. Through these complementary approaches, we have established a genetic network in which Pax2, Gata3 and Lim1 are at the top of a transcriptional hierarchy during early kidney development. Having identified Pax2, Gata3 and Lim1 as the 'core' regulators of mesonephric development, we then addressed which interactions were direct via extensive chromatin immunoprecipitation (ChIP-PCR) experiments from cell lines expressing tagged recombinant versions of Pax2, Gata3 and Lim1. We found that both Pax2 and Gata3 associate to Lim1 enhancers. We also identified Gata3 binding sites in enhancers of multiple cellular effectors, including Formin1, Diap1 and Ret. In addition, we found that Lim1 associates with enhancers on the extracellular matrix protein Npnt locus. Finally, we confirmed through in vitro reporter assays that Gata3 activates a Gata-binding site in the Ret promoter region, thus identifying Ret as a direct target gene of Gata3 in the kidney. Finally, we tested the genetic cooperativity between Pax2, Emx2, Gata3, Lim1, and Evi1 by screening a series of compound heterozygous mice for UGS anomalies. We found a high incidence of urinary tract anomalies in Pax2;Emx2 compound heterozygotes that are not found in either single heterozygotes or other allellic combinations. Pax2+/-;Emx2+/- mice harbour duplex systems associated with urinary tract obstruction, bifid ureter and a high penetrance of vesicoutreteral reflux. Remarkably, most compound heterozygotes display lower intravesical reflux pressure compared to controls. Earlier analysis of Pax2+/-;Emx2+/- embryos identified ureter budding defects as the primary cause of urinary tract anomalies. We additionally establish Pax2 as a direct regulator of Emx2 expression in the mesonephric duct. Together, these results identified a haploinsufficient combination of transcriptional kidney regulators resulting in a novel CAKUT-like phenotype in mouse. / Les anomalies congénitales du rein et des canaux urinaires (CAKUT) sont les causes les pus communes de maladies rénales chroniques chez les enfants en bas âge. CAKUT comprend un spectre d'anomalies des canaux urinaires qui se manifestent seules ou en combinaison, telles le reflux vesico-urétéral et les reins dupliqués. Les modèles de souris ont été instrumentaux dans l'identification de nouveaux régulateurs du dévelopment rénal. Chez les mammifères, le dévelopement rénal se fait en trois phases, les stades pro-, meso- et métanéphriques. Les études d'inactivations génétiques ont permis d'identifier des régulateurs essentiels à chaque stade du dévelopement rénal. Spécifiquement, les rôles individuels des facteurs de transcription Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 et Evi1 lors du dévelopement du système urogénital ont été décrits aussi bien par notre laboratoire que par d'autres. Ici, nous explorons le réseau d'interactions et de coopérativité génétiques entre ces facteurs de transcription dans le contexte du dévelopement normal et aberrant du système urogénital. Afin d'établir la hiérarchie génétique transcriptionelle entre Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 et Evi1, nous avons procédé à l'analyse de l'expression de ces facteurs, ainsi qu'à une sélection d'effecteurs dévelopementaux en aval, dans chacun des embryons mutants homozygotes respectifs. De plus, nous avons réalisé les profils d'expression génétique de Pax2 et de Gata3 par des analyses sur micropuces. Avec ces approches complémentaires, nous avons établi un réseau génétique dans lequel Pax2, Gata3 et Lim1 sont au sommet de la hiérarchie transcriptionelle lors du dévelopment rénal. Ayant identifié Pax2, Gata3 et Lim1 comme étant le 'noyau' régulateur du dévelopement mésonéphrique, nous avons ensuite déterminé quelles interactions étaient directes grâce à des immunoprécipitations de chromatine dans des lignées cellulaires exprimant des versions étiquettées (tagged) de Pax2, Gata3 et Lim1. Nous avons déterminé que Pax2 et Gata3 se lient au locus de Lim1. Nous avons également trouvé des sites où Gata3 se lie sur les locus d'effecteurs cellulaires, nottament Formin1, Diap1 ainsi que Ret. De surcroît, nous avons déterminé que Lim1 s'associe au locus de la protéine de la matrice extracellulaire Npnt. Nous avons également confirmé, grâce à une analyse in vitro, que Gata3 active un site dans la région du promoteur de Ret, identifiant ainsi Ret comme un gène cible direct de Gata3 dans le rein. Finalement, nous avons testé la coopérativité génétique entre Pax2, Gata3 Lim1, Emx2 et Evi1 en dépistant des anomalies urogénitales dans une série d'embryons de souris doubles hétérozygotes. Nous avons trouvé une haute incidence d'anomalies des canaux urinaires chez les embryons doubles hétérozygotes Pax2;Emx2, qui ne sont présentes ni chez les homozygotes ni dans les autres combinaisons alléliques. Les souris Pax2+/-;Emx2+/- ont des systèmes dupliqués associés avec des obstructions de l'uretère, des uretères bifides et une haute pénétrance de reflux vésico-urétéral. En effet, la plupart des doubles hétérozygotes ont une pression intravésicale de reflux moindre que les contrôles. L'analyse précoce des embryons Pax2+/-;Emx2+/- a permis d'identifier des défauts de bourgeonnement urétéral comme cause primaire des anomalies des canaux urinaires. De sucroît, nous avons établi Pax2 comme un régulateur direct de l'expression de Emx2 dans le tube mésonéphrique. Ensemble, ces résultats ont permis d'identifier une combinaison génétique entre deux facteurs de transcription résultant en un nouveau phénotype ressemblant au CAKUT chez la souris.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107584 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Boualia, Sami |
| Contributors | Maxime Bouchard (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
Page generated in 0.002 seconds