The ability to sense and respond to fluctuating environmental conditions is a conserved and essential feature of all living organisms. Cellular stress responses sense and transmit the demands of specific stressors to appropriate homeostatic effectors, which can then implement appropriate cellular adaptation mechanisms. This study examines two distinct and highly conserved eukaryotic signaling responses that are implemented in response to unfolded protein in the endoplasmic reticulum, a situation known as ER stress. We find that Schizosaccharomyces pombe calnexin (Cnx1p) is regulated by phosphorylation at a conserved serine residue in its cytoplasmic tail. Our analysis of Cnx1p-S553 phosphomutants suggests that this post-translational modification regulates the association of calnexin with ER membrane-bound ribosomes. We also find that this regulation of Cnx1p is important for cell size control and ER stress tolerance. Next, we identify and characterize a number of novel small-molecule inhibitors of the Ire1-dependent ER homeostatic mechanisms in Saccharomyces cerevisiae. We extend these findings beyond this yeast model by showing that one of these small-molecules also inhibits Ire1 signaling in mammalian cells. This compound, designated UPRM8, was used as a chemical probe to study the importance of Ire1-dependent ER homeostatic responses in constitutively ER-stressed multiple myeloma cells. UPRM8 elicited an apoptotic cell death in RPMI-8226 multiple myeloma cells due to its impairment of cytoprotective, Ire1-dependent ER homeostatic mechanisms. Lastly, this study also examines the roles of a cell polarity scaffold protein, called Bem1p, in the responses to pheromone and cell wall stressors in Saccharomyces cerevisiae. A novel separation of function mutant of Bem1, called Bem1-s3, was identified and it revealed that the tandem SH3 domains of Bem1p are required for efficient pheromone signaling. Furthermore, we used mass spectrometry to identify novel Bem1p-interacting proteins and post-translational modifications. These novel physical interactions, as well as the phenotypes of Bem1 null and phosphomutants, suggested a novel role for Bem1p in the adaptive response to cell wall stressors. In summary, this thesis describes stress signaling mechanisms and some methods of manipulating them in order to exert control over cell fate. / La capacité à percevoir et à répondre aux fluctuations des conditions de l'environnement est une caractéristique essentielle et conservée chez tous les organismes vivants. Les réponses aux stress cellulaires sont sensibles aux exigences de facteurs de stress spécifiques qu'elles transmettent à des effecteurs homéostatiques appropriés, et qui à leur tour induisent des mécanismes cellulaires d'adaptation. Cette étude examine deux réponses distinctes et hautement conservées qui sont mises en oeuvre en réaction à la présence de protéines incorrectement repliées dans le Réticulum Endoplasmique (RE), une situation appelée "stress réticulo-endoplasmique". Nous avons démontré que la calnexin (Cnx1p) de Schizosaccharomyces pombe est régulée par la phosphorylation d'un résidu sérine conservé et localisé à l'extrémité cytoplasmique de la protéine. Notre analyse du phospho-mutant Cnx1p-S553 suggère que cette modification post-traductionnelle régule l'association de la calnexine aux ribosomes liés à la membrane du RE. Nous avons également constaté que la régulation de la phosphorylation de la calnexine est importante pour le contrôle de la dimension cellulaire et la tolérance au stress réticulo-endoplasmique. Ensuite, nous avons identifié et caractérisé un certains nombre de nouvelles petites molécules qui sont des inhibiteurs des mécanismes d'homéostasie du RE dépendant d'Ire-1 chez Saccharomyces cerevisiae. Ces résultats ont été étendu au-delà du modèle de la levure, en montrant que l'une de ces petites molécules inhibe également la voie de signalisation d'Ire-1 chez des cellules de mammifères. Ce composé, désigné par UPRM8, a été utilisé comme test chimique pour étudier l'importance de la réponse homéostatique au stress réticulo-endoplasmique constitutivement présent chez les cellules de myélomes multiples. UPRM8 induit une apoptose chez les cellules de myélomes multiples RPMI-8226 en empêchant les mécanismes cyto-protectifs dépendants d'Ire-1. Finalement, cette étude a également examiné les rôles d'une protéine impliquée dans la polarité cellulaire, appelée Bem1p, dans la réponse à une phéromone et à un facteur de stress de la paroi cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae. Un nouveau mutant de Bem1, nommé Bem1-s3, a été identifié et a révélé que les domaines SH3 en tandem de Bem1p sont requis pour une signalisation efficace des phéromones. De plus, nous avons utilisé la spectrométrie de masse pour identifier de nouvelles protéines qui interagissent avec Bem1p ainsi que des modifications post-traductionnelles. Ces nouvelles interactions ainsi que les phénotypes des mutants Bem1 et Bem1p ont suggéré un nouveau rôle pour Bem1p dans la réponse adaptative à des facteurs de stress de la paroi cellulaire. En résumé, cette thèse décrit des mécanismes de signalisation du stress et des moyens mises en œuvre par la cellule afin de composer avec les facteurs de stress et d'exercer un contrôle sur son devenir.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.104488 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Waller, Daniel |
| Contributors | David Thomas (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
Page generated in 0.0076 seconds