The short isoforms of the CUX1 transcription factor have been implicated in various cancer-related processes in tissues culture experiments and were found to contribute to tumorigenicity in transgenic mice. In addition, CUX1 is over-expressed in many human cancers. The functions attributed so far to CUX1 stem from its activity as a transcription factor. However, it is possible that CUX1 plays a non-transcriptional role in the cell. Tandem affinity purification, followed by mass spectrometry, identified numerous binding partners of CUX1. The aim of my studies was to validate and further characterize the interactions of CUX1 with some of these proteins: REV1, PARP1 and Ku70/Ku80. REV1 is an error-prone DNA polymerase involved in translesion synthesis and is responsible for most point mutations in yeast and mammalian cells. We showed that the REV1-CUX1 interaction required the REV1 BRCT domain and was increased following irradiation. I have shown that CUX1 was phosphorylated following DNA damage. My results indicated that ATM phosphorylated CUX1 and that phosphorylation of CUX1 at serines 861, 868 and 1100 promoted its interaction with REV1. ChIP-on-chip experiments showed that REV1 preferentially localized to transcribed regions, that the recruitment increased after gamma-irradiation and that 12.9% of REV1 binding sites overlapped CUX1 binding sites. I have optimized and characterized two reporter assays for point mutations (GFPstop and ouabain resistance) and showed that point mutation frequency correlated, at least in part, with the ability of a promoter to recruit REV1. Reduction in REV1 expression led to a decrease in expression of numerous genes. We propose that the physiological purpose for REV1 recruitment to transcribed regions is to enable efficient transcription of actively transcribed genes, by preventing stalled replication forks from blocking the passage of the transcription machinery. Ku and PARP1 are sensors of DNA damage and promote DNA damage repair. I have validated the interaction of CUX1 with Ku and PARP1 and showed that expression of CUX1 fragments led to their displacement from known promoter targets. Using various experimental approaches, my results indicated that in addition to its transcriptional role, CUX1 might play a non-transcriptional role in the repair of strand breaks. / Le facteur de transcription CUX1, et plus particulièrement ses isoformes courtes, sont impliquées dans différents processus associés au développement cancéreux dans des expériences de culture de tissus et dans des modèles de souris transgéniques. De plus, CUX1 est sur-exprimé dans de nombreux cancers humains. Les fonctions attribuées jusqu'à présent à CUX1 sont associées à son activité transcriptionelle. Cependant, il est possible que CUX1 joue un rôle non-transcriptionel dans la cellule. La purification par affinité en tandem, couplée à la spectrométrie de masse, a permis d'identifier plusieurs partenaires d'interaction de CUX1. Le but de mes études a été de valider et caractériser les interactions de CUX1 avec certaines de ces protéines, plus précisément REV1, PARP1 et Ku70/Ku80. REV1 est une ADN polymérase de faible fidélité lors de la synthèse d'ADN impliqué dans le processus de synthèse à travers les lésions (translesion synthesis) et responsable de la plupart des mutations ponctuelles chez la levure, ainsi que chez les mammifères. Nous avons montré que l'interaction entre REV1 et CUX1 nécessitait le domaine BRCT de REV1 et que leur affinité respective augmentait suite à l'irradiation. J'ai montré que CUX1 était phosphorylé suite aux dommages à l'ADN. Mes résultats ont indiqué que ATM phosphorylait CUX1 et que les phosphorylations de CUX1 sur les serines 861, 868 et 1100 favorisaient son interaction avec REV1. Des expériences de localisation génomique par puce ont montré que REV1 était localisé de manière préférentielle dans des régions transcrites, que cette localisation augmentait suite à l'irradiation aux rayons gamma et que 12.9% des sites de localisation de REV1 se superposaient aux sites de localisation de CUX1.J'ai optimisé et j'ai caractérisé deux essais rapporteurs pour l'analyse des mutations ponctuelles (GFPstop et résistance à l'ouabain) et j'ai montré que la fréquence des mutations ponctuelles corrélait, en partie, avec la capacité des promoteurs à recruter REV1. Une réduction de l'expression de REV1 a induit la réduction de l'expression des nombreux gènes. Nous suggérons que le rôle physiologique du recrutement de REV1 au sein de régions génomiques transcrites est de permettre la transcription efficace des gènes transcrits activement, en prévenant le blocage du passage du complexe transcriptionel normalement induit par les fourches de réplication arrêtées à cause du dommage à l'ADN. Ku et PARP1 sont des détecteurs du dommage à l'ADN et stimulent la réparation de l'ADN. J'ai validé l'interaction de CUX1 avec Ku et PARP1 et j'ai montré que, suite à l'expression des fragments de CUX1, Ku et PARP1 ne se localisaient plus sur certaines de leurs cibles génomiques. En utilisant différentes approches expérimentales, mes résultats ont indiqué que, en plus de son rôle transcriptionel, CUX1 pourrait jouer un rôle non-transcriptionel dans la réparation des cassures de l'ADN.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119486 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Hulea, Laura |
| Contributors | Alain Nepveu (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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