CUX1 is a transcription factor implicated in the control of cell proliferation. Over-expression of CUX1 is observed in many human tumors and cancer cell lines. Cells constitutively over-expressing the p110 isoform of CUX1 proliferate faster and spend less time in G1 following quiescence. We studied three aspects of CUX1 function and regulation during the cell cycle. In the first part of this study we investigated how over-expression of p110 CUX1 results in a shortened G1. Using quantitative PCR we showed that over-expression of p110 CUX1 caused an increase in the transcription of DDK genes (cdc7 and Dbf4) upon exit from quiescence. Western blot analysis revealed that p110 CUX1 cells display elevated phosphorylation of MCM2 serine 5 (pS5-MCM2) during quiescence, indicating an increased activity of DDK. This was associated with a faster loading of MCM2 onto the chromatin after re-entry into the cell cycle and a shortening of G1 as shown by FACS. In a set of experiments, we investigated how the phosphorylation of CUX1 by cyclinD1-CDK4 contributes to cell cycle regulation. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) analysis revealed that phosphorylation of a recombinant CUX1 protein (1125-1505) by cyclinD1-CDK4 inhibited its DNA binding while PKA activated it. Another recombinant CUX1 protein (1125-1308), missing the C-terminal repression domains, is activated by cyclinD1-CDK4 and inhibited by PKA. Autoradiography and western blot analysis revealed that cyclinD1-CDK4 phosphorylates CUX1 on S1216 while PKA phosphorylates S1215 and S1216. FACS analyses showed that cells expressing mutant p110 CUX1S1215/1216A decrease in size with extended passages in culture and eventually die by apoptosis, indicating the importance of cyclinD1-CDK4 regulation in maintaining cell size. Thirdly, during mitosis CUX1 appears ~15kDa larger when observed by SDS-PAGE. We wanted to search for any large post translational modifications such as ubiquitin. No such modifications were identified, however, using mass spectrometry we demonstrated that during mitosis CUX1 is phosphorylated on at least twelve residues compared to six during G2. / CUX1 est un facteur de transcription impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire. La surexpression de CUX1 est observée dans de nombreuses tumeurs humaines et lignées de cellules cancéreuses. Les cellules qui surexpriment constitutivement l'isoforme p110 de CUX1 prolifèrent plus rapidement et passent moins de temps en G1 après quiescence. Nous avons étudié trois aspects de la régulation de CUX1 au cours du cycle cellulaire. Dans la première partie de cette étude, nous avons analysé le mécanisme par lequel la surexpression de p110 CUX1 conduit à une réduction dans la durée de la phase G1. En utilisant la méthode de PCR quantitative, nous avons montré que la surexpression de p110 CUX1 a augmenté la transcription de gènes DDK (Cdc7 et Dbf4) à la sortie de quiescence. L'analyse par immuno-buvardagea révélé que les cellules p110 CUX1 montrent une phosphorylation élevée de pS5-MCM2 pendant la quiescence, ce qui indique une augmentation de l'activité de DDK. Cette phosphorylation élevée est associée à un chargement plus rapide de MCM2 sur la chromatine après entrée dans le cycle cellulaire et un raccourcissement de la phase G1 tel que mesuré par FACS. Dans un deuxième projet, nous avons étudié l'effet de la phosphorylation de CUX1 par le complexe cyclin D1/CDK4 sur la régulation du cycle cellulaire. Des test de liaison à l'AND ont révélé que la phosphorylation d'une protéine recombinante CUX1 (1125-1505) par cyclinD1-CDK4 inhibeé sa liaison à l'ADN tandis que la PKA l'active. À l'inverse, une autre protéine recombinante CUX1 (1125-1308), qui ne contient pas les domaines répression en C-terminaux, est activée par cyclinD1-CDK4 et inhibée par la PKA. L'autoradiographie et l'analyse par immuno-buvardage ont révélé que cyclinD1-CDK4 phosphoryle la sérine 1216, alors que PKA phosphoryle sur les sérines 1215 et 1216. Les analyses par FACS ont montré que les cellules exprimant un mutant p110 CUX1S1215/1216A passent moins de temps en G1, deviennent progressivement plus petites et finissent par mourir par apoptose. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de CUX1 par le complexe cyclinD1-CDK4 sert à contrôler la taille des cellules. Finalement, au cours de la mitose, CUX1 semble ~ 15 kDa plus grands quand on l'observe par SDS-PAGE. Nous avons vérifié si cette différence de poids moléculaire résultait de modifications post-traductionnelles telles que l'ajout d'un peptide de la famille des ubiquitines. Aucune de ces modifications n'a été identifiée, mais en utilisant la spectrométrie de masse, nous avons démontré que, durant la mitose, CUX1 est phosphorylé sur au moins douze résidus par rapport à six au cours de G2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119509 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Lantela, Daniel |
| Contributors | Alain Nepveu (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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