The Hedgehog (Hh) signaling pathway is an essential and highly conserved pathway required for embryonic development and adult tissues homeostasis in both invertebrates and vertebrates. In humans, abnormal Hh signaling leads to numerous congenital diseases and deregulation of Hh signaling is associated with certain aspects of tumorigenesis. Therefore, a complete characterization of this pathway may help us to better understand the role of Hh signaling under physiological and pathological conditions. A key transducer of Hh signaling is Smoothened (Smo), a seven-pass transmembrane protein and distant member of the G-protein-coupled receptor (GPCR) family. In the absence of the secreted Hh protein, Smo is inhibited by another membrane protein, the Hh-receptor Patched (Ptc). Hh binding to Ptc releases this inhibition and triggers accumulation of Smo at the cell surface. Phosphorylation of Smo by Protein kinase A (PKA) and additional kinases allows Smo to adopt an active conformation, which turns the Hh signaling pathway on and ultimately allows the expression of Hh target genes. G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) are known to phosphorylate active GPCRs and promote homologous desensitization of GPCR signaling. Smo is a functional GPCR in Drosophila and several recent studies suggest that GRKs participate in Hh signaling in both invertebrates and vertebrates. To address the role of GRKs in Drosophila Hh signaling, we analyzed flies mutant for gprk2, one of two GRKs in flies. Interestingly, gprk2 mutant flies display defects typical of impaired Hh signaling, suggesting that Gprk2 is required for transducing the Hh signal. Further studies, however, showed that Gprk2 also plays a negative role in Hh signaling by promoting Smo desensitization, which is consistent with typical GRK biology. To explain the dual and contradictory role of Gprk2 in Hh signaling, we hypothesized that heterotrimeric G-protein-dependent signaling may be affected in gprk2 mutants through misregulation of Smo and other GPCRs. Consistent with this idea we find that basal cAMP levels are abnormally low in gprk2 mutants. Cellular cAMP concentrations control the activity of PKA, the key activator of Smo. With genetic experiments, we confirmed that cAMP levels and PKA activity are limiting for Hh target gene expression in gprk2 mutants. In conclusion, our results suggest that Gprk2 regulates Hh signaling in two ways. On one hand, it limits Hh signaling by promoting homologous desensitization of Smo. On the other hand, it is also required to keep cellular cAMP concentrations in a physiological range that is required for normal Hh signaling. We speculate that the abnormally low cAMP levels in gprk2 mutants are not only caused by misregulation of Smo, but also by a more global misregulation of GPCR signaling, suggesting that Hh signalling is affected by signalling cross-talk. / La voie de signalisation Hedgehog (Hh) est une cascade de signalisation essentielle et hautement conservée, requise lors du développement embryonnaire et le maintien de l'homéostasie dans les tissus adultes, tant chez les invertébrés que chez les vertébrés. Chez l'homme, une signalisation anormale de cette voie de signalisation entraîne de nombreux défauts congénitaux, et est associée à certains aspects de la tumorigénèse. Ainsi, une caractérisation complète de cette cascade signalitique nous aiderait à mieux comprendre le rôle de Hh dans des conditions physiologiques et pathologiques. La protéine Smoothened (Smo) est une composante importante de la signalisation par Hh. Smo est composée de sept domaines transmembranaires et fait partie de la famille de "G-protein-coupled receptor" (GPCR). En absence de Hh, Smo est inhibée par la protéine membranaire "Hh-receptor Patched" (Ptc). La liaison de Hh à Ptc relâche l'inhibition qu'exerce cette dernière sur Smo, qui s'accumule alors à la surface de la cellule. La phosphorylation de Smo par la Protéine kinase A (PKA) ou d'autres kinases permet à Smo d'adopter sa conformation dite active, qui enclenche alors la cascade signalitique qui induit l'expression des gènes cibles de Hh.Il a été démontré que les protéines "G-protein-coupled receptor kinases" (GRKs) phosphorylent les GPCRs actives et promouvoient ainsi la désensibilisation à leur signalisation. De récentes études suggèrent que les GRKs participent à la signalisation par Hh chez les invertébrés et chez les vertébrés. Afin de mieux comprendre le role des GRKs dans la signalisation de Hh chez la drosophile, nous avons analysé des mouches mutantes pour gprk2, l'une des deux GRKs présentes dans ce modèle. Surprenament, les mouches mutantes pour gprk2 présentent des défauts qui sont typiques à la voie de signalisation Hh. Ceci suggère que Gprk2 est requise pour transmettre les signaux de signalisation en aval de Hh. Toutefois, de plus amples études ont révélées que Gprk2 régule aussi de façon negative cette voie de signalisation en induisant la désensibilisation à Smo. Afin d'expliquer les rôles contradictoires de Gprk2 dans la voie de signalisation Hh, nous avons émis l'hypothèse que les défauts de signalisation par les GPCRs observés chez les mouches mutantes pour gprk2 sont dûs à une mauvaise regulation de Smo et d'autres GPCRs. Ainsi, nous avons découvert que les niveaux basals d'AMPc sont anormalement bas chez les mutants de gprk2. Les concentrations intracellulaires d'AMPc régulent l'activité de la PKA, qui elle-même régule Smo. À l'aide d'expériences génétiques, nous avons confirmé que les bas niveaux d'AMPc et de l'activité de la PKA limitent l'expresssion des gènes cibles de Hh chez les mutants de gprk2. En conclusion, nous résultats suggèrent que Gprk2 régule la signalisaiton de Hh de deux façons distinctes. D'une part, elle régule la signalisation en amont de Hh en induisant la désensibilisation à Smo. D'autre part, Gprk2 est requise afin de maintenir les niveaux d'AMPc à des niveaux physiologiques, ce qui est nécessaire pour une signalisation normale de Hh. Nos résultats suggèrent que les niveaux anormalement faible d'AMPc chez les mutants de gprk2 ne sont pas dûs uniquement à une mauvaise regulation de Smo, mais à une mauvaise regulation plus globale de GPCRs en general. Ainsi, la signalisation par Hh semble être régulée par différentes boucles de rétroactivation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119539 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Cheng, Shuofei |
| Contributors | David Hipfner (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Anatomy and Cell Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
Page generated in 0.0075 seconds