Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by chronic inflammation, synovial hyperplasia and joint destruction. The pathogenic mechanisms responsible for RA remain poorly understood both systemically and in the microenvironment of diarthrodial joint. Here we hypothesized, based on previous observations, that there is a positive interaction between resident mast cells and synovial fibroblasts (SF) within the rheumatoid synovial compartment. Our principal objectives were to define the cellular and molecular interactions between infiltrating mast cells and resident human synovial fibroblasts (HSF), and we focused our efforts on two genes, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LO), both implicated in the inflammatory response associated with RA. Furthermore, our research led to the discovery of novel epigenetic mechanisms governing the regulation of 5-LO gene expression in RA-affected SF. Epigenetics refers to heritable changes in gene expression regulated by DNA methylation, histone modifications and RNA interference. Epigenetic regulation is critical for normal development and differentiation. But environmental factors can trigger epigenetic dysregulation, leading to the development of many diseases, including cancer and autoimmune diseases. Using Western and Northern blot analyses in addition to reporter assays, we demonstrated that mast cell-derived leukotriene B4 (LTB4) contributes to the modulation of inflammatory response in part through stabilization of COX-2 mRNA and protein expression in SF, the key enzyme in prostaglandin biosynthesis and the target of all non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Further transient and stable transfection experiments verified that LTB4 exerted this COX-2 stabilization effect at the post-transcriptional level through Ras/c-Raf/MEK1/2/ERK1/2/p42 AUF1 signaling pathway. Genomic bisulfite sequencing was used to detect DNA methylation profiles of 5-LO gene (rate limiting in LTB4 synthesis) in HSF, mast cells and other cell types. The 5-LO gene promoter (DNA CpG islands) was heavily methylated in U937 cells (5-LO negative), but unmethylated in HL-60 cells (5-LO positive). Compared to the 5-LO-positive HMC-1 cells, the 5-LO-negative HMC-1 cells had much higher methylation levels of CpG islands in the promoter region. We found a strong correlation between 5-LO gene expression and DNA methylation in HMC-1 cells. Dexamethasone (DEX) treatment of HMC-1 cells increased the expression of 5-LO, a process associated with reduced methylation of histone H3 on lysines 9 and 27. Interestingly, osteoarthritic (OA)/RA HSF are 5-LO negative; though the promoter region is CpG hypomethylated, histone H3 is hypermethylated at Lys-9 and -27 residues.The research in this thesis provided innovative insights into the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in inflammatory diseases like RA. The elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved in these studies may help to establish new therapeutical targets in the treatment of RA patients. Moreover, the bisulfite sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) techniques used in this thesis provide reliable procedures for DNA methylation and histone modification studies in various inflammatory diseases and cancers. / L'arthrite rhumatoïde est caractérisée par une inflammation chronique, une hyperplasie de la membrane synoviale et la destruction des jointures. Notre hypothèse, basé sur des observations précédentes, qu'il y avait une interaction positive entre les cellules mastocytes résidentielles et les fibroblastes synoviaux dans le compartiment de la synovial rhumatoïde. Nos objectifs principaux étaient de définir les interactions cellulaires et moléculaires entre les cellules mastocytes infiltrantes et les fibroblastes synoviaux résidentielles, en particulier deux gènes, la cyclooxygénase-2 et la 5-lipoxygénase (5-LO), tous deux impliquées dans la réponse inflammatoire associée à l'arthrite rhumatoïde. De plus, notre recherche a abouti à la découverte de mécanismes épigénétiques gouvernant la régulation de l'expression du gène de la 5-LO chez les fibroblastes synoviales atteint d'arthrite rhumatoïde. L'épigénétique est l'ensemble des modifications de l'expression des gènes contrôlés par la méthylation de l'ADN, les modifications aux histones liées à l'ADN et par interférence ARN transmissibles d'une génération de cellule à l'autre. La régulation épigénétique est indispensable pour la différentiation et le développement normal. Cependant, des facteurs environnementaux peuvent entamer un désordre épigénétique causant ainsi plusieurs maladies, tels que le cancer et des maladies auto-immunes.Avec les méthodes d'analyse par buvardage Western et Northern, en plus des essais rapporteurs, nous avons démontré que le leukotriène B4 (LTB4) produit par les cellules mastocytes contribues à la modulation de la réponse inflammatoire en parti par la stabilisation de l'ARN messager de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et de l'expression de la protéine chez les fibroblastes synoviaux, l'enzyme clé de la biosynthèse des prostaglandines et la cible de tous les drogues anti-inflammatoires non stéroïdiens. De plus, les expériences de transfections transitoires et stables ont démontré que le LTB4 a exercé cet effet de stabilisation de la COX-2 au niveau post-transcriptionnelle par l'intermédiaire de la voie de signalisation de Ras/c-Raf/MEK1/2/ERK1/2/p42 AUF1. Le séquençage génomique avec traitement au bisulfite a été utilisé pour déterminer le profile de méthylation de l'ADN du gène de la 5-LO (enzyme clé dans la synthèse du LTB4) chez les fibroblastes synoviaux humains, les cellules mastocytes et d'autres types cellulaires. Le promoteur du gène 5-LO (îlots d'ADN CpG) était fortement méthylé chez les cellules U937 (5-LO négatif), cependant chez les cellules HL-60 le promoteur n'était pas méthylé (5-LO positif). En comparant les cellules HMC-1 qui expriment la 5-LO aux cellules HMC-1 qui n'expriment pas la 5-LO, ces derniers avaient de fort niveaux de méthylation des îlots CpG dans la région du promoteur. Nous avons trouvé une forte corrélation entre l'expression du gène 5-LO et la méthylation de l'ADN chez les cellules HMC-1. Le traitement des cellules HMC-1 avec la dexamethasone (DEX) augmente l'expression de la 5-LO, un processus associé à la réduction de la méthylation de l'histone H3 sur les lysines 9 et 27. Il est intéressant de voir que les fibroblastes synoviaux humains ostéoarthritique (OA)/RA sont 5-LO négatif; quoique la région du promoteur CpG est hypométhylé alors que l'histone H3 est hyperméthylé aux lysines 9 et 27.La recherche de cette thèse propose un cheminement innovateur à la compréhension des mécanismes physiopathologique impliqué dans les maladies inflammatoires telle que l'arthrite rhumatoïde. L'élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ses études peuvent aider à l'établissement de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde. De plus, la technique de séquençage de l'ADN avec le traitement au bisulfite utilisé dans cette thèse est fiable pour des études de méthylation de l'ADN et la modification des histones chez plusieurs maladies inflammatoires ainsi que les cancers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96964 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Zhai, Beibei |
| Contributors | Giovanni Di Battista (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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