The HIV-1 RNA genome encodes the main structural polyprotein Gag, Gag/Pol (structural proteins and enzymes), auxiliary (Vpr, Vpu, Vif) and regulatory proteins (Tat, Rev, Nef). The expression of the full complement of viral gene products enhances both the replication and the pathogenic potential of the virus. In our previous work we showed that HIV-1 expression prevented eIF2alpha-dependent stress granule (SG) assembly in cells. SGs are translationally silent sites of RNA triage and can be readily visualized in cells due to clustering of cytoplasmic RNA and the recruitment of multiple cytoplasmic proteins (e.g., TIA/R, G3BP and eIF3). In this work, we attempted to understand how HIV-1 blocks SG formation and defined the determinant in HIV-1 that mediates this. To initiate SG assembly, the drug Pateamine A was used. Pateamine A causes an activation of eIF4A, which will lead to a disassembly of the eIF4F complex and an arrest in translation all in an eIF2alpha-independent manner. To identify the responsible gene, proviral constructs with individually deleted auxiliary and regulatory viral genes were expressed in HeLa cells. Among the proviral deletion constructs tested, two were found to be unable to block SG assembly: pNLXX, and Rev-. Both of these constructs share one important similarity in that they all do not express the main structural protein Gag due either to the presence of premature stop codons (pNLXX) or the nuclear retention of the genomic RNA that encodes Gag (Rev-). To directly test the hypothesis that the Gag polyprotein alone blocks stress granule assembly, we transfected cells with various mammalian expression constructs of Gag. These all prevented SG assembly. We went on to further map the responsible domain of Gag to the N-terminus of the Capsid domain, specifically to two amino acids. In conclusion, HIV-1 Gag prevents SG assembly via the N-terminus of Capsid and may confer to the virus a replicative advantage during times of stress. / Le génome du virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) comprend les protéines structurales principales Gag, Gag/Pol (structurale et enzymatique), auxiliaires (Vpr, Vpu, Vif) et régulatrices (Tat, Rev, Nef). L'expression de toutes ces protéines virales augmente la réplication et le potentiel pathogène du virus. Nos résultats précédents montrent que l'assemblage des granules de stress par un processus dépendant de eIF2alpha peut être bloqué par l'expression des gènes du VIH-1. Les granules de stress sont des sites de triage d'ARN sans traduction et elles peuvent être visualisées grâce à l'accumulation d'ARN cytoplasmique et au recrutement de plusieurs protéines cytoplasmiques (TIA/R, G3BP and eIF3, par exemple). Les résultats présentés ici montrent comment le VIH-1 empêche la formation des granules de stress et caractérisent les facteurs impliqués dans ce processus. Pour provoquer la formation de granules de stress, le composé Pateamine A a été utilisé. Pateamine A cause l'activation de eIF4A, qui provoque la dissolution du complexe eIF4F et arrête la traduction par un processus indépendant de eIF2alpha. Pour identifier le gène du VIH qui empêche la formation de granules de stress, des constructions provirales individuellement déficientes dans un gène auxiliaire ou régulateur ont été exprimées dans des cellules HeLa. Parmi les constructions provirales testées, deux étaient incapables de prévenir la formation de granules de stress: pNLXX, et Rev-. Ces deux constructions ne peuvent pas exprimer la protéine structurale Gag, soit à cause de la présence de codons stop prématurés (pNL-XX), soit à cause de la rétention dans le noyau de l'ARN viral codant pour Gag (Rev-). Pour déterminer si la polyprotéine Gag est suffisante pour empêcher la formation de granules de stress, des cellules HeLa ont été transfectées avec plusieurs différents vecteurs exprimant Gag. Tous ont empêché la formation de granules de stress. De plus, nous avons déterminé que l'extrémité N-terminale du domaine de Capside de Gag est responsable de cette inhibition. En particulier, l'activité anti-granules de stresse réside dans deux acides aminés. Ainsi, la protéine Gag du VIH-1 empêche la formation de granules de stress via l'extrémité N-terminale de la Capside et pourrait donner au virus un avantage réplicatif dans des conditions de stress.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110455 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Vyboh, Kishanda |
| Contributors | Andrew J Mouland (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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