Hepatitis C (HCV) non-structural protein 5a (NS5a) is an RNA binding protein that plays an essential role in viral replication and assembly. NS5a domain I (NS5a-DI) forms a dimer and has been crystalized in two different conformations. The specific amino acid residues involved in dimerization and RNA binding are currently unknown, however, the dimeric form of NS5a-DI is proposed to be the active RNA binding conformation. There are currently no cell-free assays to study the NS5a dimerization and only a limited number of RNA-binding assays. We non-specifically labeled NS5a-DI with fluorescent Cy3 or Cy5-maleimide dyes under optimized conditions and used the occurrence of FRET as a measure of dimerization when Cy3-NS5a-DI was incubated with Cy5-NS5a-DI. Competition assays were also performed by adding unlabeled RNA to Cy3—NS5a-DI and Cy5-NS5a-DI and monitoring the change in FRET values. In addition, we measured direct binding of RNA to NS5a by the occurrence of FRET when Cy3-NS5a-DI was incubated with unlabeled RNA in the presence of a cationic conjugated polymer (CP+) donor. Our direct RNA binding CP+ assay shows that a FRET signal is observed when CP+ is incubated with RNA and Cy3-NS5a-DI, but abolished when RNA is replaced with DNA. This suggests that NS5a-DI binds RNA, but not DNA, as expected. Our NS5a dimerization assay shows a dose responsive FRET value when different concentrations of Cy3-NS5a-DI are incubated with Cy5-NS5a-DI. This FRET signal is reversed by increasing salt concentration, suggesting the observed FRET is a result of reversible dimer formation rather than irreversible aggregation. Competition assays with unlabeled RNA results in a dose response decrease of FRET between Cy3-NS5a-DI and Cy5-NS5a-DI, suggesting that RNA binding affects dimerization. Our results lay the basis for the development of novel plate-based assays capable of using FRET to characterize NS5a dimers and their interactions. / La protéine non structurale 5a (NS5a) du virus de l'hépatite C (VCH) est une protéine de liaison à l'ARN qui joue un rôle essentiel dans la réplication virale et l'assemblage du virus. Le domaine I de NS5a (NS5a-DI) forme un dimère, et la structure de ce domaine a été cristallisée dans deux conformations différentes. Les résidus spécifiques d'acides aminés impliqués dans la dimérisation et de liaison à l'ARN sont inconnus. Cependant, la forme dimère de NS5a-DI est proposé d'être la conformation active de liaison d'ARN. Présentement, il n'y a actuellement aucune technique biochimique établit pour étudier la dimérisation de NS5a, et seul un nombre limité de techniques existe pour mesurer la liaison à l'ARN. Nous avons lié un colorant fluorescent Cy3 ou Cy5- maléimide chimiquement à NS5a-DI d'une manière non spécifique au site de fixation, en utilisant des conditions optimisées. Par le suite, nous avons utilisé la présence de FRET en tant que mesure de dimérisation lorsque Cy3-NS5a-DI a été incubée avec Cy5-NS5a-DI. Des essais de compétition ont également été réalisées en observant la variation des valeurs de FRET après l'ajout d'ARN sans fluorophore à Cy3-NS5a-DI et Cy5-NS5a-DI. Nous avons également mesuré la liaison directe de NS5a à l'ARN par la présence de FRET quand Cy3-NS5a-DI a été incubée avec l'ARN sans fluorophore en présence d'un polymère cationique conjugué (PC+) comme donneur de fluorescence. Notre essai de liaison directe d'ARN par PC+ montre qu'un signal de FRET est observé lorsque PC+ est incubé avec l'ARN et Cy3-NS5a-DI, mais est aboli lorsque l'ARN est remplacé par de l'ADN. Ceci suggère que NS5a-DI se lie à l'ARN, mais pas à l'ADN, comme prévu. Notre essai de dimérisation pour NS5a montre une valeur de FRET avec une relation de dose-réponse lorsque différentes concentrations de Cy3-NS5a-DI sont incubées avec Cy5-NS5a-DI. Ce signal de FRET est diminué en augmentant la concentration de sel, suggérant le signal de FRET est observé à la suite de la formation de dimères réversibles plutôt que de l'agrégation irréversible. Des essais de compétition avec l'ARN sans fluorophore demontrent une diminution dans la dose-réponse de FRET entre Cy3-NS5a-DI et Cy5-NS5a-DI, ce qui suggère que la liaison à l'ARN affecte dimérisation. Nos résultats créent une base pour le développement de nouveaux essais basés sur la plaque de 96 puits capables d'utiliser la technique de FRET pour caractériser les dimères de NS5A et leurs interactions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119687 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Rickard, Jenaya |
| Contributors | Matthias Gotte (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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