Viruses are intracellular pathogens that use the host cell to produce new infectious progeny. For all positive-strand RNA viruses that have been investigated so far, viral replication takes place in cytoplasmic virus-induced membrane structures. For turnip mosaic virus (TuMV), the generation of vesicles likely associated with the replication complex depends on the synthesis of the viral protein 6K. To further characterize the vesicles formed during TuMV infection, Nicotiana benthamiana plants were agroinfiltrated with a TuMV infectious clone expressing 6K protein fused to GFP. Using confocal microscopy, cytoplasmic aggregates were observed, corresponding to the 6KGFP-induced vesicles which house the viral replication complexes (VRCs). Intracellular movement of these vesicles was visualized by time-lapse imaging. Vesicle trafficking was inhibited when plants were infiltrated with latrunculin B, an inhibitor of microfilament polymerization. The absence of movement had severe effects on viral accumulation. Viral vesicles also aligned with actin filaments. These results indicate that microfilaments are necessary for VRC trafficking which is important for virus infectivity. / The biogenesis of viral vesicles was investigated by infecting cells with two recombinant TuMVs producing 6KGFP or 6KmCherry-labelled vesicles. Individual vesicle within a cell contained unique protein products derived from each recombinant demonstrating the origin of a vesicle from a single viral genome. Green and red sectoring was also observed, meaning that vesicles could fuse together. The presence of the eukaryotic translation factors eIF(iso)4E, PABP and eEF1A enclosed in VRC was demonstrated previously by our group. These data combined to a single-genome origin suggest that viral translation occur within these structures. The same host factors were also found to co-localize with the active replicating sites along with viral proteins VPg-Pro, RdRp and CI using immunofluorescence labelling in infected protoplasts. These data bring accumulating evidence for the possible coupling of viral translation and replication. / Les virus sont des parasites intracellulaires qui utilisent la cellule hôte pour produire une nouvelle descendance infectieuse. Pour tous les virus à ARN positif étudiés jusqu'à maintenant, la réplication virale prend place dans des structures membranaires induites par le virus. Chez le virus de la mosaïque du navet (TuMV), la formation de vésicules probablement associées au complexe de réplication dépend de la synthèse de la protéine virale 6K. Afin de caractériser les vésicules formées durant l'infection de TuMV, des plants de Nicotiana benthamiana ont été agroinfiltrés avec un clone infectieux de TuMV exprimant la protéine 6K fusionnée à GFP. Des agrégats cytoplasmiques ont été observés par microscopie confocale, correspondant aux vésicules induites par la protéine 6KGFP et abritant le complexe de réplication virale (VRC). Le mouvement intracellulaire de ces vésicules a été visualisé par imagerie time-lapse. Le trafic des vésicules a été inhibé lorsque les plantes étaient infiltrées avec de la latrunculin B, un inhibiteur de polymérisation des microfilaments. L'absence de mouvement a également conduit à une sévère diminution de l'accumulation virale. Les vésicules colocalisent avec les filaments d'actine. Ces résultats indiquent que les microfilaments sont nécessaires au mouvement des vésicules lequel est important pour l'infection virale. / La biogenèse des vésicules virales a été investiguée en infectant les cellules avec deux clones infectieux de TuMV produisant des vésicules étiquetées par 6KGFP ou 6KmCherry. Des vésicules individuelles contenant des protéines uniques dérivant d'un seul clone recombinant a démontré que l'origine des vésicules provient d'un seul génome. Des vésicules ayant des secteurs vert et rouge ont aussi été observé, indiquant que la fusion de vésicules est possible. La présence des facteurs eucaryotes de traduction eIF(iso)4E, PABP et eEF1A à l'intérieur des vésicules a été démontré par notre groupe. Ces données combinées à l'origine unique des vésicules suggèrent que la traduction virale se produit à l'intérieur de ces vésicules. Les mêmes facteurs de traduction ainsi que les protéines virales VPg-Pro, RdRp et CI colocalisent avec les sites de réplication active dans des protoplastes infectés. Ces données apportent des indices supplémentaires sur la possibilité de couplage entre la traduction et la réplication virale chez TuMV.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.86558 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Cotton, Sophie |
| Contributors | Jean-Francois Laliberte (Supervisor2), Suha Jabaji (Supervisor1) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Plant Science) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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