The HIV-1 accessory protein Vif (virion infectivity factor) is required for HIV-1 to replicate in certain "non-permissive" cell types, which include major targets of HIV-1, such as primary T lymphocytes and macrophages, as well as T-cell lines such as H9. Vif is not required for viral replication in other "permissive" cell types such as SupT1, Jurkat, 293, HeLa, and CEM-SS lines. Recent studies demonstrate that non-permissive cells contain a protein called human APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G), which prevents HIV-1 replication in the absence of Vif. The human APOBEC3G (hA3G) is incorporated into HIV-1 during viral assembly, and inhibits HIV-1 replication in newly-infected cells. Vif is able to bind to hA3G in the cytoplasm, and induces degradation of hA3G through proteasome-dependent pathway. This prevents the incorporation of hA3G into HIV-1, thereby abolishing the anti-HIV activity of hA3G. Our project mainly focuses on the antiviral mechanism of hA3G. It has been shown that the presence of hA3G in HIV-1 strongly inhibits the ability of the virus to produce new viral DNA upon infection. Our new observation is that the reduction in late DNA synthesis is due to the hA3G induced inhibition of strand transfer steps in reverse transcription. Analysis of viral cDNA intermediates in vivo reveals that hA3G causes an inhibition of the minus and plus strand transfers, without having a significant impact on DNA elongation. Using an in vitro system to measure minus strand transfer similarly shows a dose-dependent reduction of strand transfer by hA3G. This inhibition of strand transfer occurs independently the editing activity of hA3G and is correlated with its ability to prevent RNaseH degradation of the template RNA. As hA3G expresses in human cells hosting HIV-1, inhibition of Vif-mediated hA3G degradation clearly represents a new anti-HIV-1 strategy for drug discovery. We have established a screening system to discover inhibitors that protect hA3G from Vif-mediated degradation. Through screening, compounds IMB-26 and IMB-35 were identified to be specific inhibitors for the degradation of hA3G by Vif. The inhibitors suppressed HIV-1 replication in hA3G-containing cells but not in those without hA3G. The anti-HIV effect correlated with the endogenous hA3G level. HIV-1 particles from hA3G-expressing cells treated with IMB-26/35 contained a hA3G level higher than that from those without IMB-26/35 treatment, and showed decreased infectivity. IMB-26/35 blocked Vif/hA3G interaction, and therefore protected hA3G from Vif-mediated degradation. The compounds were safe with an anti-HIV therapeutic index >200 in vitro. LD50 of IMB-26 in mice was >1000 mg/kg (intraperitoneally). / La protéine virale du VIH-1 Vif (virion infectivity factor) est nécessaire pour la réplication du VIH dans certains types de cellules dites non permissibles. Ces types de cellules incluent les cellules souches des lymphocytes T et des macrophages, ainsi que les lignées cellulaires des lymphocytes T, comme la lignée H9. Parmi ce groupe de lignées cellulaires, certaines sont les cibles naturelles du virus. Vif n'est pas nécessaire pour la réplication du VIH dans d'autres types de cellules dites permissibles, comme les lignées SupT1, Jurkat, 293, HeLa, et CEM-SS. Des études récentes ont démontré que les lignées non permissibles contiennent la protéine APOBEC3G (Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G). La protéine humaine APOBEC3G (h3AG) est incorporée dans la particule virale durant l'assemblage du VIH et bloque la réplication du virus suite à l'infection de nouvelles cellules. Vif lie la protéine h3AG dans le cytoplasme et induit sa dégradation par le proteasome, ce qui rends les cellules non permissibles susceptibles à l'infection par le VIH.Notre projet consiste à étudier le mécanisme antiviral du h3AG. Il a déjà été montré que le hA3G inhibe la production d'ADN suite à une nouvelle infection. Nous avons remarqué que la réduction de la synthèse d'ADN est le résultat de l'inhibition de changement de brin pendant la transcription reverse. L'analyse des intermédiaires d'ADNc durant la réplication in vivo révèle que le hA3G inhibe les transferts des brins positifs et négatifs sans affecter l'étape d'élongation durant la synthèse d'ADN. Des tests menés in vitro montrent une réduction du transfert bu brin négatif dépendante de la dose du hA3G. Cette inhibition est indépendante de l'activité d'édition du hA3G, mais elle dépend de la capacité du h3AG à inhiber la dégradation de la matrice d'ARN, une étape accomplie par la RNase H. Puisque la hA3G est produite dans les cellules humaines infectées par le VIH, l'inhibition de sa dégradation par Vif constitue une cible potentielle dans un traitement éventuel contre la VIH. Alors, nous avons mis au point un système de criblage pour découvrir des inhibiteurs qui empêcheraient la dégradation de la hA3G par Vif. Nous avons identifié deux composés, IMB-26 et IMB-35, qui inhibent spécifiquement cette dégradation. Ces inhibiteurs ont bloqué la réplication du VIH dans des cellules qui contiennent la hA3G mais n'ont pas montré d'effets sur des cellules qui ne contiennent pas la hA3G. Nous avons observé une corrélation entre le niveau du hA3G et l'effet antivirale. Le traitement des cellules avec les composés IMB-26/35 augmente le niveau du hA3G et diminue la capacité du virus d'infecter de nouvelles cellules. En culture cellulaire, les index thérapeutique de ces composés est >200. Ce qui prévoit qu'ils seront sécuritaires. Chez les souris, la LD50 du IMB-26 est >1000 mg/kg (intra péritonéale). En conclusion, notre projet a permis l'identification de deux nouveaux composés antiviraux qui agissent en stabilisant la hA3G.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.97017 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Li, Xiaoyu |
| Contributors | Lawrence Kleiman (Supervisor1), Shan Cen (Supervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
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| Relation | Electronically-submitted theses. |
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