Kainate receptors are members of the ionotropic glutamate receptor family and are widely expressed throughout the mammalian central nervous system where they act as regulators of network activity. Given this, there is considerable interest in KAR gating, both to improve our understanding but also to aid in drug design. And the most striking and unique aspect of KAR gating is their strong sensitivity to and absolute requirement for external ions.Altering either the species or concentration of external cations such as Na+ or external anions such as Cl- can dramatically affect the extent and duration of KAR activation. These parallel effects are not seen with closely related AMPA receptors. But how can ions of opposite charge exert the same effect on KARs? Using rapid agonist application techniques in conjunction with point mutations and existing crystal structures, we found that anions and cations regulate KARs through a dipole mechanism. Specifically, both anions and cations bind adjacent to one another at the crucial interface between KAR ligand binding domains (LBDs). This important position, called the dimer interface, and close apposition accounts for their common effects. Given the role of this dimer interface in KAR agonist efficacy, and that external ions bind to this interface, we examined whether anions and cations regulate the relative efficacy of KAR agonists. We found that cations, but surprisingly not anions, control the relative strength of KAR agonists through this dimer interface site. We also observed a general inverse relationship between peak and equilibrium activation across all agonists and ionic conditions. Full agonists produce large peak responses with relatively small equilibrium activation but as agonist efficacy decreases the relative size of the equilibrium response increases. This ubiquitous behaviour, found in both AMPAR and KARs, is best reproduced by simulations which explicitly model conformational changes occurring after agonist binding but before channel opening. More generally, such pre-gating transitions may be a crucial determinant of agonist efficacy at KARs, and perhaps all other ligand-gated ion channels. In the course of these experiments, we uncovered an unexpected ability of the smallest cation, Li+, to potentiate KAR peak and equilibrium activation as well as to slow decay kinetics. Surprisingly, this effect was only seen with agonists containing a pyrrolidine ring structure, KA and Dom, demonstrating agonist-dependent conformations of the intact receptor. Moreover, Li+ potentiation of these agonists occurs from a novel binding site distinct from the known cation binding site. My results lead to four general conclusions. First, cations and anions regulate KAR through a dipole mechanism. Second, despite their dipole arrangement, cations but not anions govern KAR relative agonist efficacy. Third, agonist efficacy at KARs maybe determined by pre-gating transitions. And finally, KARs posses a Li+-selective allosteric site which potentiates activation in an agonist-dependent manner. These conclusions advance our understanding of KAR gating but also suggest some new ideas about partial agonism which may apply to other ligand-gated ion channels. / Les récepteurs kaïnate (KARs) sont des récepteurs ionotropes glutamatergiques qui sont exprimés à travers le système nerveux central, où ils agissent en tant que régulateurs de réseaux neuronaux. Par conséquent, il est considérablement pertinent d'étudier leur fonctionnement afin d'approfondir nos connaissances ainsi que pour aider à la conception de médicaments. Les aspects les plus frappants et particuliers de ces récepteurs sont leur forte sensibilité ainsi que leur dépendance inconditionnelle à la présence d'ions externes.Changer l'identité ou la concentration des cations externes, tel le Na+, ou des anions externes, tel le Cl-, peut avoir un effet important sur l'ampleur et la durée de l'activation des KARs. Ces effets interdépendants ne sont pas observés chez les récepteurs AMPA (AMPARs). Comment des ions de charge opposée peuvent-ils avoir le même effet sur les KARs? À l'aide d'applications ultra-rapides d'agonistes sur des KARs recombinants, de mutagénèse et des structures cristallines existantes, nous avons trouvé que les anions et les cations régulent les KARs par un méchanisme de dipôle. Spécifiquement, les anions et les cations se lient de façon adjacente à l'interface entre les domaines d'interaction du ligand des KARs. Cette importante région, nommée interface des dimères, ainsi que l'apposition étroite des ions, expliquent leurs effets communs.Étant donné le rôle de cette interface dans l'efficacité des KARs, et que les ions externes se lient à cette interface, nous avons décidé d'examiner si les anions et les cations régulent le potentiel relatif des agonistes des KARs. Nous avons découvert que les cations, mais étonnamment pas les anions, pouvaient contrôler ce potentiel à travers l'interface des dimères. Nous avons également observé une relation inverse entre l'activation maximale et à l'équilibre pour tous les agonistes et conditions ioniques. Les agonistes complets produisent une activation maximale considérable et une activation à l'équilibre relativement petite, mais lorsque l'efficacité de l'agoniste diminue, l'activation à l'équilibre devient relativement plus grande. Ce comportement omniprésent, observé chez les AMPARs et les KARs, peut être reproduit de façon optimale par des simulations modelant des changements de conformation qui se produisent après la liaison d'un agoniste mais avant l'ouverture du canal ionique. En général, de telles étapes transitoires pourraient être cruciales pour l'efficacité d'un agoniste agissant sur les KARs et peut-être même sur d'autres canaux ioniques ligand-dépendants.À travers ces expériences, nous avons découvert la capacité inattendue du plus petit cation, le Li+, de potentialiser l'activation maximale et à l'équilibre des KARs, ainsi que de ralentir leur désensibilisation. Étonnamment, cet effet fut seulement observé avec les agonistes contenant un anneau pyrrolidine, c'est-à-dire le kaïnate et le domoate, démontrant ainsi des conformations agoniste-dépendantes du récepteur intact. De plus, l'effet potentiateur du Li+ pour ces agonistes se produirait à travers un nouveau site de liaison non-identifié qui serait distinct du site de liaison des cations déjà connu.Mes résultats nous mènent vers quatre conclusions. Premièrement, les cations et les anions régulent les KARs à travers un méchanisme de liaison en dipôle. Deuxièmement, malgré leur disposition en dipôle, seuls les cations gouvernent l'efficacité relative des agonistes des KARs. Troisièmement, l'efficacité de ces agonistes pourrait être déterminée par une étape transitoire de pré-activation. Enfin, les KARs possèdent un site de liaison sélectif au Li+ qui potentialise leur activation de façon allostérique et agoniste-dépendante. Ces conclusions approfondissent notre compréhension de la régulation des KARs par les ions externes, et proposent aussi de nouvelles idées concernant l'agonisme partiel qui pourraient s'appliquer à d'autres canaux ioniques ligand-dépendants.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.104693 |
| Date | January 2011 |
| Creators | MacLean, David |
| Contributors | Derek Bowie (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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