The objective of this thesis is the development and use of a novel fluorescence fluctuation technique for determining the oligomeric state of fluorescently labeled proteins in situ via microscopy imaging. High order moment analysis of fluorescence intensity fluctuations from individual confocal laser scanning microscopy (CLSM) images applied to study monomer-oligomer distributions of fluorescently labeled proteins was developed. Using computer simulations and experiments with fluorescent microspheres and organic fluorescent dyes, the detection limits and accuracy of this statistical approach were determined. A series of control experiments were carried out to support the membrane receptor oligomerization studies in this thesis. The methods were then applied to study oligomerization states in various biological systems. Epidermal growth factor receptors (EGFR) play a critical role in cell growth, proliferation and survival. The activation steps of signal transduction pathways are known to involve EGFR oligomerization. Pharmacodynamic studies of ligand-induced clustering of EGF receptors were carried out. Spatial intensity distribution analysis (SpIDA), which accurately measures monomer-dimer distributions, was used to measure the increase in EGFR dimeric population upon addition of EGF ligand. The distribution of aggregates forming in the course of EGFR internalization was evaluated using two-population moment analysis. The findings supported an existing model proposing two distinct receptor internalization pathways. The electrogenic sodium bicarbonate cotransporter NBCe1-A plays an important role in absorbing sodium bicarbonate across the basolateral membrane of the proximal tubule. The fluorescence moment image analysis and SpIDA were applied to study the oligomeric state of NBCe1-A in cultured mammalian cells expressing various mutants of cotransporter. Spatial fluctuation analysis revealed that NBCe1-A existed on the cell membrane predominantly as a monomer and negligibly as higher order oligomers. To measure the oligomerization state of the native cotransporter, samples of rat kidney tissues were prepared and the native NBCe1-A was immunostained using fluorescently labeled primary antibody against the wild type cotransporter. The image analysis showed that NBCe1-A was present on the proximal tubule basolateral membrane in predominantly dimeric and rarely monomeric or higher order oligomeric states. Human immunodeficiency virus (HIV) diverts the cellular ESCRT machinery to promote the release of newly formed virions from host cells. The ATPase, VPS4A, acts at a late stage of ESCRT function. It provides energy for dissociation of ESCRT complexes and membrane abscision. The fluorescence moment analysis of VPS4A-eGFP images revealed the monomeric distribution of the protein in the plasma membrane outside budding sites and formation of two to five VPS4A dodecamers at the budding sites. The combination of the results of VPS4A dynamics studies together with the VPS4A burst size analysis shed light on steps in the HIV lifecycle and release. / L'objectif de cette thèse réside dans le développement et l'utilisation d'une nouvelle technique de mesure de fluctuation de fluorescence. Cette technique d'imagerie par microscopie permet de déterminer in situ l'état d'oligomérisation de protéines couplées à un fluorophore. L'analyse par mesure de moments d'ordres supérieurs d'intensité de fluctuation de fluorescence d'images obtenues à partir d'un microscope confocal à balayage laser (CLSM) a été développée afin de mesurer la distribution en monomères/oligomères de protéines marquées par fluorescence. En utilisant des simulations par ordinateur ainsi que des expériences avec des microsphères fluorescentes, les limites de détection et l'exactitude de cette approche statistique ont pu être déterminées. Une série d'expériences contrôles a été effectuée afin de valider l'étude d'état d'oligomérisation de récepteurs membranaires présentée dans cette thèse. Cette méthode a ensuite été appliquée à l'étude de l'état d'oligomérisation dans divers systèmes biologiques. Le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) joue un rôle critique dans la croissance, la prolifération et la survie cellulaire. Les étapes d'activation des voies de transduction du signal sont connues pour impliquer l'oligomérisation de l'EGFR. Des études de pharmaco-dynamique d'agglomération provoquée par liaison d'un ligand ont été conduites. La technique d'analyse de distribution spatiale d'intensité (SpIDA), qui permet de mesurer précisément la distribution de monomères/dimères a été utilisée pour mesurer l'augmentation de la population de dimères d'EGFR après liaison du ligand (EGF). La distribution des agrégats se formant au cours de l'internalisation d'EGFR a été mesurée par analyse de moments pour deux populations. Les résultats confirment une hypothèse proposant deux voies distinctes d'internalisation du récepteur. Le co-transporteur électrogénique au bicarbonate de sodium NBCe1-A joue un rôle important dans l'absorption du bicarbonate de sodium à travers la membrane baso-latérale du tubule proximal rénal. Les analyses par moments de fluorescence et SpIDA ont été appliquées pour étudier l'état d'oligomérisation de NBCe1-A dans des cellules mammifères en cultures exprimant plusieurs mutants du co-transporteur. L'analyse de fluctuation spatiale montre que NBCe1-A est présent majoritairement sous forme de monomère sur la membrane cellulaire et de façon négligeable sous forme d'oligomères d'ordres supérieurs. Afin de mesurer l'état d'oligomérisation du co-transporteur naturel, des échantillons de reins de rats ont été préparés et NBCe1-A a été marqué par immunoréaction avec des anticorps fluorescents reconnaissant le type naturel du co-transporteur. L'analyse d'image indique que NBCe1-A est présent sous forme de dimère et rarement sous forme de monomère ou d'oligomères d'ordre supérieurs sur la membrane baso-latérale des tubules proximaux. Le virus humain d'immunodéficience (VIH) détourne la machinerie cellulaire ESCRT pour promouvoir la sortie de la cellule hôte de virions nouvellement formés. L'ATPase VPS4A est impliquée à une étape avancée de la fonction ESCRT en produisant de l'énergie pour la dissociation du complexe ESCRT et l'invagination de la membrane plasmique. L'analyse du moment de fluorescence d'images de VPS4A-eGFP montre une distribution monomérique à l'extérieur des sites de bourgeonnement ainsi que la présence de deux à quatre dodécamères sur les sites de bourgeonnement. La combinaison des résultats des études de la dynamique de VPS4A ainsi que l'analyse de la taille des pics d'intensité lumineux permet de mieux comprendre le cycle de vie du VIH ainsi que son processus de relargage.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96703 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Sergeev, Mikhail |
| Contributors | Paul Wiseman (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Physics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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