Aminoglycosides are broad-spectrum antibiotics that corrupt normal protein synthesis by acting on the coding and translocation mechanisms of the 30S ribosomal subunit. The most common mechanism of resistance to this class of antibiotics is enzymatic modification. There are three families of aminoglycoside modifying enzymes: the N-acetyltransferases (AAC), the O-phosphotransferases (APH), and the O-adenyltransferases (ANT). The focus of this thesis is on the APH and ANT families. Spectinomycin kinase (SpcN), also referred to as APH(9)-Ib, catalyzes the phosphorylation of spectinomycin exclusively, rendering it inactive. It shares its substrate specificity with APH(9)-Ia, for which the crystal structure has been described (Fong et al, 2010). Structural elements related to substrate binding remain largely conserved within the APH family, and the structural characterization of various APHs can provide valuable insight into structure-function relationships, such as substrate spectrum. Here, we report initial overexpression and purification methods for SpcN and explore solubilization methods to improve protein overexpression. Aminoglycoside nucleotidyltransferase (2”)-Ia (ANT(2”)-Ia) is among the most prevalent and widespread AMEs in North America (Ramirez & Tomalsky, 2010). It catalyzes the transfer of adenosine monophosphate to the 2” position of 4-6-disubstituted aminoglycosides, preventing binding to the 30S ribosomal subunit. Its clinical relevance makes it an important target for structure-based drug design. Previous studies of ANT(2”)-Ia were limited due to the formation of inclusion bodies during ANT(2”)-Ia overexpression (Ekman et al., 2001). Here, we report the increase in protein solubility and stability as a result of cleaving 50 extraneous amino acids from the N-terminus. Overexpression and purification of this construct yields 17 mg of soluble, stable, and active protein per liter of culture. We used heteronuclear single quantum correlation (HSQC) and HNCACB, CBCAcoNH triple resonance NMR experiments to characterize the protein. We sequentially assigned 144 of the 176 non-proline amide backbone residues of ANT(2”)-Ia. Titration analyses of ANT(2”)-Ia with tobramycin and ATP separately at 1:1 concentration ratios show unique global chemical shift perturbations for each, suggesting different binding pockets for both substrates. / Les aminosides sont une classe d'antibiotiques à large spectre qui affectent l'efficacité de la synthèse protéique. Parmi les mécanismes de résistance contre cette classe d'antibiotique, l'inactivation enzymatique est le plus souvent fréquenté. Il existe trois classes d'enzymes capable d'inactiver les aminosides: les N-acetiltransferases (AAC), les O-phosphotransferases (APH), et les O-adeniltransferases (ANT). Cette thèse discutera les familles ANT et APH. Spectinomycin kinase (SpcN), aussi nommé APH(9)-Ib, catalyse la phosphorylation et l'inactivation de l'aminoside spectinomicin exclusivement. Il partage cette spécificité du substrat avec APH(9)-Ia, pour lequel la structure cristallographique à déjà été caractérisée (Fong et al., 2010). Étant donné que les éléments structurels reliés à la liaison du substrat et au site de reconnaissance sont largement conservés parmi les membres de la famille APH, les études sur la configuration tridimensionnelle des APH fournissent des informations importantes sur la relation entre structure et fonction, dont la spécificité du site de reconnaissance par exemple. Cette thèse explique les démarches prisent pour exprimer, solubiliser et purifier SpcN.L'aminoside nucleotidilstransferase 2"-Ia (ANT(2")-Ia) est parmi les enzymes de résistance contre les aminosides les plus souvent fréquentés (Ramirez & Tomalsky, 2010). Il catalyse le transfert de adénosine monophosphate à la position 2" des aminosides 4,6-bisubstituées, ce qui les empêchent de se lier au sous-unité 30S du ribosome. Son importance dans le milieu clinique fait en sorte qu'il et un cible intéressant pour la recherche et le développement d'antibiotiques basée sur les structures tridimensionnelles. À date, les études sur ANT(2")-Ia on été limitées par le fait qu'il s'exprime de façon non soluble (Ekman et al., 2001). Nos études, décrient dans cette thèse, propose une nouvelle forme soluble et active de ANT(2")-Ia qui serait la version plus physiologiquement exacte. Nous avons pu obtenir 17 mg de protéine pure, soluble et active à partir d'un litre de culture. Nous avons fait l'attribution séquentielle des déplacements chimiques des atomes de la chaîne principale par RNM en utilisant des expériences bi- et tri-dimensionnelles, dont HSQC et HNCACB et CNCAcoNH. Nous avons complété l'attribution de 144 des 176 résidus (excluant les prolines). Nous avons aussi fait des analyses de titration avec les substrats de ANT(2")-Ia, ATP et tobramicin séparément, à une concentration de 1:1. Ces analyses démontrent des perturbations globales des déplacement chimiques uniques pour chaque interaction, ce qui suggère que les sites de reconnaissances pour chaque substrat sont différents.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.121350 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Sabet-Kassouf, Nilufar |
| Contributors | Albert Berghuis (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses |
Page generated in 0.0021 seconds