The latch-state is the capacity of smooth muscle to maintain force for long periods of time with low energy consumption. The prevalent theory to explain the latch-state suggests that if myosin gets deactivated (dephosphorylated) while attached to actin, it remains attached and maintains force. Other theories suggest that dephosphorylated and detached myosin can bind to actin to maintain force and that actin regulatory proteins participate in the force maintenance. All theories of the latch-state were based on measurements performed at the whole muscle level and were never confirmed at the molecular level. Verifying the latch-state theories at the molecular level was the main goal of this thesis.To further our understanding of the latch-state, the role of calponin in the binding of unphosphorylated myosin to actin was determined. The laser trap assay was used to measure the average force of unbinding (Funb) in the absence and presence of calponin. Calponin enhanced the Funb. Phosphorylation of calponin with Ca2+-calmodulin dependant protein kinase II, which detaches calponin from actin, decreased the Funb to the unregulated actin level. Performing the measurements at high ionic strength, which detaches calponin from myosin, had the same effect on the Funb. These later two measurements demonstrate that calponin enhances the Funb of unphosphorylated myosin to actin by crosslinking them together. Next, the effect of caldesmon on the Funb was studied; caldesmon enhanced the Funb. Because tropomyosin is known to potentiate biochemical and mechanical effects of caldesmon, its action on the Funb in combination with caldesmon was also measured. Tropomyosin enhanced the Funb on its own but had no synergistic effect with caldesmon. Phosphorylation of caldesmon with the extracellular signal-regulated kinase (ERK) decreased the Funb below the unregulated actin level. Because ERK phosphorylation of caldesmon occurs late in the contraction, this last result suggests a relaxation mechanism from the latch-state. Examination of the force traces revealed a visco-elastic behavior of myosin in the presence of ERK phosphorylated caldesmon which either prevents binding or promotes detachment from actin, thus leading to muscle relaxation. Finally, the ultimate molecular level demonstration of the latch-state requires dephosphorylation of myosin during molecular force measurements with a laser trap assay. However, addition of myosin light chain phosphatase cannot be done without disturbing the single molecule level mechanics measurements. Thus, a microfluidic device was designed and developed to allow the addition of chemicals to a molecular mechanics flow-through chamber without creating any bulk flow. A micro-channel chamber was created by standard photolithography on silicon wafers with the patterns transferred to polymethylsiloxane (PDMS). The chamber was then bound to a polycarbonate membrane which itself was bound to the molecular mechanics chamber. The micro-channels assured rapid distribution of the chemicals whereas the membrane assured efficient delivery but prevented bulk flow. The device was tested by injection of adenosine triphosphate to initiate the propulsion of actin by myosin. The proof of principle of this microfluidic device concludes this thesis. / Le muscle lisse possède la capacité unique de maintenir une force élevée tout en consommant peu d'adénosine triphosphate (ATP); cette propriété est appelée 'latch-state'. La théorie la mieux connue pour expliquer cet état suggère que si la myosine est désactivée (déphosphorylation de sa chaîne légère) pendant qu'elle est attachée à l'actine, elle reste attachée et maintient la force. D'autres théories suggèrent que la myosine désactivée et détachée peut s'attacher à l'actine pour maintenir la force et que les protéines régulatrices de l'actine participent aussi à cet effort. Toutes les théories sur l'état 'latch' ont été extrapolées à partir de mesures réalisées sur la totalité du muscle sans jamais être confirmées au niveau moléculaire. Le but principal de cette thèse était de vérifier les théories de l'état 'latch' au niveau moléculaire. Afin de mieux comprendre l'état 'latch', le rôle de la calponine, dans l'attachement de la myosine non-phosphorylée à l'actine, a été déterminé. Des pinces optiques ont été utilisées pour mesurer la force moyenne de leur détachement (Funb) en l'absence et en présence de la calponine. La calponine a augmenté la Funb. La phosphorylation de la calponine avec l'enzyme protéine kinase II (Ca2+-calmoduline dépendante), qui a pour effet de détacher la calponine de l'actine, a diminué la Funb jusqu'au niveau de l'actine non-régulée. De plus, des mesures de force ont été réalisées à haute force ionique, détachant cette fois-ci la calponine de la myosine. Ceci a aussi diminué la Funb jusqu'au niveau de l'actine non-régulée. Ces résultats montrent que la calponine augmente la Funb de la myosine non-phosphorylée à l'actine par liaison croisée (myosine-calponine-actine). Ensuite, l'effet de la caldesmone sur la Funb a été étudié; la caldesmone augmente aussi la Funb. Puisque la tropomyosine est connue pour promouvoir les actions biochimiques et mécaniques de la caldesmone, son action sur la Funb en combinaison avec la caldesmone a aussi été mesurée. La tropomyosine augmente la Funb lorsqu'elle est seule mais n'a pas d'effet synergétique avec la caldesmone. La phosphorylation de la caldesmone avec la kinase régulatrice des signaux extracellulaires (ERK) a diminué la Funb en dessous du niveau de l'actine non-régulée. Ce dernier résultat suggère un mécanisme de relaxation à partir de l'état 'latch' étant donné que la phosphorylation de la caldesmone par ERK se produit tard dans la contraction. D'autre part, l'examen des traces de force a révélé un comportement viscoélastique de la myosine en présence de la caldesmone phosphorylée, ce qui semble soit prévenir l'attachement, soit promouvoir le détachement de l'actine, menant ainsi à la relaxation du muscle à partir de l'état 'latch'. Finalement, la démonstration ultime de l'état 'latch' au niveau moléculaire requiert la déphosphorylation de la myosine pendant les mesures de forces moléculaires faites à l'aide de pinces optiques. Cependant l'addition de la phosphatase de la chaîne légère de myosine ne peut se faire sans perturber les mesures de mécanique au niveau moléculaire. A cet effet, un appareil micro-fluidique a été conçu et développé pour permettre l'ajout de solutions biochimiques à la chambre de mesure de micromécanique sans créer de débit net. Des micro-canaux ont été créés par photolithographie sur substrats de silicium suivie d'un transfert des formes sur polymethylsiloxane (PDMS). La chambre des micro-canaux a ensuite été collée à une membrane de polycarbonate qui elle a ensuite été collée à la chambre de micromécanique. Les micro-canaux assurent la livraison rapide et uniforme tandis que la membrane assure le transfert efficace des produits biochimiques tout en empêchant un débit net. Le fonctionnement de l'appareil a été vérifié en injectant de l'ATP en présence d'actine et de myosine phosphorylée. La propulsion de l'actine par la myosine a été observée validant ainsi le principe de l'appareil microfluidique.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.121358 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Roman, Horia Nicolae |
| Contributors | Anne-Marie Lauzon (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biomedical Engineering) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses |
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