In fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS), fluctuations in the fluorescence signal emitted by molecules diffusing in a sample of interest are analyzed to extract information about the properties of the molecules themselves, such as their concentration, molecular brightness, or diffusion coefficients. Most techniques, however, either analyze correlations over time to extract information about the diffusion properties of the sample, or analyze fluctuations in the amplitude to extract information about the molecular brightness of the different species in the sample, but cannot do both. We first extend dual color photon counting histograms theory, a brightness analysis method that monitors the brightness of different species in two spectral channels, so that the observation volumes in each channel can be of different sizes, which is necessary if different excitation wavelengths are used for each channel. We then extend the theory so that the two channels can be shifted in time from one another, so that both correlation information and amplitude information can be extracted simultaneously. This new method, which we call correlated photon counting histograms (cPCH), is sensitive to both the brightness and diffusion properties of the sample of interest. We also derive expressions for the factorial cumulants of cPCH, which provide a convenient and efficient means of summarizing the information in the distributions. We show that fluorescence correlation spectroscopy (FCS) curves can be generated using the first joint moment of the cPCH distribution, while a regular photon counting histogram (PCH) can be generated at any time shift by summing over the photon counts in one channel. We show, using simulated data, that cPCH can resolve two different species with less uncertainty than either FCS or PCH if the two species differ in both their brightness and diffusion properties. If spectral information can be used as well, dual color cPCH can resolve two different species with less uncertainty than single channel cPCH. We develop a novel fitting algorithm that takes advantage of the analytical solutions to the factorial cumulant equations to sample the parameters that are consistent with the data, by resampling the measured factorial cumulants using the measured variances of each factorial cumulant. We show, using simulated data, that the parameter set that results in the minimum fit energy is often a poor estimate of the actual parameters used to create the data. We develop extensions to the theory that take into consideration triplet states, longer binning times, detector dead-times, and detector afterpulsing. Next, we extend cPCH so that it can be applied to images. Spatial cPCH allows both immobile and mobile species in a series of images to be resolved, using their brightness and diffusion properties, and can be used to generate spatiotemporal information about the different species in the sample. Finally, we develop models to take into account the effect that the photomultiplication process in analog photomultiplier tubes can have on the signal statistics, making fluorescence fluctuation spectroscopy techniques such as spatial cPCH available to a wider range of researchers. / En spectroscopie de fluctuation de fluorescence (FFS), les fluctuations du signal de fluorescence émis par des molécules diffusantes dans un échantillon d'intérêt sont analysés pour extraire des informations sur les propriétés des molécules elles-mêmes, comme leur concentration, la luminosité moléculaire, ou des coefficients de diffusion. Cependant, la plupart des techniques analyse des corrélations dans le temps pour extraire des informations sur les propriétés de diffusion de l'échantillon, ou bien analyse les fluctuations de l'amplitude pour extraire des informations sur la luminosité moléculaire des différentes espèces dans l'échantillon, mais ne peut pas faire les deux. Nous étendons d'abord la théorie de histogramme de comptage de photons bicolores, une méthode d'analyse de la luminosité qui surveille la luminosité de différentes espèces dans deux canaux spectraux, de sorte que les volumes d'observation dans chaque canal peut être de tailles différentes, ce qui est nécessaire si des longueurs d'onde d'excitation différentes sont utilisées pour chaque canal. Ensuite nous améliorons la théorie de telle sorte que les deux canaux peuvent être décalées dans le temps les uns des autres, de sorte que les détails de corrélation et d'amplitude peuvent être extraits simultanément. Cette nouvelle méthode, que nous appelons histogramme de comptage de photons corrélés (cPCH), est sensible à la luminosité et des propriétés de diffusion de l'échantillon d'intérêt. Nous dérivons également des expressions pour les cumulants factoriels de cPCH, qui fournissent un moyen pratique et efficace de résumer l'information contenue dans les distributions. Nous montrons que les courbes de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) peuvent être générées en utilisant le premier moment conjoint de la distribution cPCH, tandis qu'un histogramme de comptage de photons (PCH) régulier peut être généré à tout décalage dans le temps par sommation sur les comptages de photons dans un canal. Nous montrons, en utilisant des données simulées, que le cPCH peut résoudre deux espèces différentes avec moins d'incertitude que soit FCS ou PCH si les deux espèces sont distiguées à la fois par leur luminosité et leur propriétés de diffusion. Si l'information spectrale peut être utilisée aussi bien, cPCH bicolore peut résoudre deux espèces différentes avec moins d'incertitude que cPCH seul canal. Nous développons un nouvel algorithme de montage qui utilise des solutions analytiques aux équations cumulants factoriels pour échantillonner les paramètres qui sont compatibles avec les données, par rééchantillonnage des cumulants factoriels mesurées en utilisant les variances mesurées de chaque cumulant factoriel. Nous montrons, en utilisant des données simulées, que le jeu de paramètres qui se traduit par l'énergie d'ajustement minimale est souvent une mauvaise estimation des paramètres réels utilisés pour créer les données. Nous développons des extensions de la théorie qui considères les états triplets, les intervalles de classe plus longues, le temps morts du détecteur, et les post impulsions (afterpulsing) du détecteur. Ensuite, nous étendons cPCH afin qu'il puisse être appliqué aux images. cPCH spatiale permet de résoudre des espèces à la fois immobiles et mobiles dans une série d'images, à l'aide de leur luminosité et de leurs propriétés de diffusion, et peut être utilisé pour générer des informations spatio-temporelle sur les différentes espèces dans l'échantillon. Enfin, nous développons des modèles pour tenir compte de l'effet que le processus de photomultiplication dans les tubes photomultiplicateurs analogues peut avoir sur les statistiques du signal, ce qui rend les techniques de spectroscopie de fluctuation de fluorescence comme cPCH spatiale disponible à un éventail de chercheurs plus large.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119417 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Scales, Nathan |
| Contributors | John W Hanrahan (Supervisor1), Peter Swain (Supervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Physiology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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