TrkA es va descobrir com a un oncogén producte de la fusió del seu domini tirosinakinasa (TK) amb la tropomiosina. Posteriorment, va augmentar el seu interès endescobrir-se que la proteïna nativa constituïa el receptor del factor de creixementnerviós (NGF).Es coneixen bé els esdeveniments que tenen lloc a partir de la unió del lligand alreceptor i que donen lloc a l'activació de les vies de senyalització de les MAPK yPI 3-K/Akt. Se sap que, in vivo, la internalització del receptor i el seu transportretrògrad també juguen un paper important per a l'efecte a llarg termini del NGF ique és un tret distintiu en relació a d'altres receptors de factors de creixement.L'activació del receptor també comporta un augment transitori de Ca2+intracel· lular. Per això ens vam plantejar l'estudi de la relació entre l'activació deTrkA i calmodulina (CaM), com a sensor dels nivells de Ca2+ intracel· lulars.En primer lloc vam observar una interacció directa i dependent de Ca2+ entre CaM ila meitat c-terminal del domini intracel· lular de TrkA. La primera part del treball secentra en caracteritzar aquesta interacció.Per veure l'efecte de la unió sobre Trk, vam utilitzar inhibidors de CaM. Aquestsno impedeixen la fosforilació de TrkA induïda per NGF, però sí comporten laproteòlisi del receptor donant lloc a un fragment amb activitat tirosina kinasaconstitutiva. Donada la ubiqüitat de CaM, i la seva importància en processos vitalsper a la cél· lula, el segon objectiu ha consistit en buscar el lloc d'unió a CaM deTrkA per així poder obtenir una construcció de Trk on es perdés la unió a CaM.Basant-nos en diverses evidències, ens vam centrar en la caracterització d'una regióque conté una Tyr fosforilable (Y701) i que forma part d'un motiud'internalització. L'última part del treball se centra en descriure les característiquesd'aquesta Tyr i la seva funció, que més enllà de la relació amb CaM, pot constituiruna fosforilació inhibitòria per l'activitat de Trk i un lloc de regulació negativa dela internalització. / TrkA se descubrió como un oncogén producto de la fusión de su dominio tirosinakinasa (TK) con la tropomiosina. Posteriormente, aumentó su interés trasdescubrirse que la proteína nativa constituía el receptor del factor de crecimientonervioso (NGF).Se conocen bien los acontecimientos que ocurren tras la unión del ligando alreceptor y que dan lugar a la activación de las vías de señalización de las MAPK yPI 3-K/Akt. Se sabe que, in vivo, la internalización del receptor y su transporteretrógrado también juegan un papel importante para el efecto a largo plazo delNGF y que es una característica distintiva de otros receptores de factores decrecimiento.La activación del receptor también conlleva un aumento transitorio de Ca2+intracelular. Por ello nos planteamos estudiar la relación entre la activación deTrkA y calmodulina (CaM), como sensor de los niveles de Ca2+ intracelulares.En primer lugar observamos una interacción directa y Ca2+ dependiente entre CaMy la mitad c-terminal del dominio intracelular de TrkA. La primera parte del trabajose centra en caracterizar esta interacción.Para ver el efecto de la unión sobre Trk, utilizamos inhibidores de CaM. Éstos noimpiden la fosforilación de TrkA inducida por NGF, pero sí conllevan la proteolisisdel receptor dando lugar a un fragmento con actividad tirosina kinasa constitutiva.Dada la ubicuidad de CaM y su importancia en procesos vitales para la célula, elsegundo objetivo consistió en buscar el sitio de unión a CaM de TrkA, para asípoder obtener una construcción de Trk en que se perdiera la unión a CaM.Basándonos en diversas evidencias, nos centramos en la caracterización de unaregión que contenía una Tyr fosforilable (Y701) y que además forma parte de unmotivo de internalización. La última parte del trabajo se centra en describir lascaracterísticas de dicha Tyr y su función,que más allá de la relación con CaM,puede constituir una fosforilación inhibitoria para la actividad de Trk y un lugar deregulación negativa de su internalización. / TrkA was discovered as an oncogen, product of the fusion of its Tyrosine kinasedomain with Tropomiosin. Later on, it was identified as the receptor for the Nervegrowth factor (NGF).The first steps in Trk signaling after ligand binding are well understood. And alsothe pathways leading to MAPKs and PI3K-Akt activation. But receptorinternalization and retrograde transport are also important for the long termsignaling of TrkA, giving raise to a differential regulation of Trk receptors amongother growth factor receptors.Receptor activation also induces an increase in intracellular calcium concentration.That's why we thought on studying the relationship between TrkA activation andcalmodulin (CaM), as a prototypical calcium sensor.First we described a direct and calcium-dependent interaction between CaM andthe c-terminal part of TrkA. The first part of this work consists on thecharacterization of this interaction.In order to check the effect of CaM binding on TrkA we used CaM inhibitors.NGF-induced TrkA fosforilation was not inhibited upon CaM inhibition, but Trkwas cleaved, leading to constitutively active fragments. CaM is ubiquous andnecessary for many cell processes, so the second objective has been to search forthe CaM binding domain on TrkA in order to generate a TrkA mutant defective inCaM binding.We mutated a region containing a phosphorylatable Tyrosine Y701 that constitutesa trafficking motif, as the putative binding site of CaM. The last part of this projectdeals with the characterization of the mutants, and their effect even regardless ofCaM binding. Its phosphorylation might inhibit Trk function, and the regionconstitutes a negative regulator of internalization.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UDL/oai:www.tdx.cat:10803/8082 |
| Date | 26 June 2006 |
| Creators | Pablo Llavall, Yolanda de |
| Contributors | Comella i Carnicé, Joan Xavier, 1963-, Llovera i Tomàs, Marta, Universitat de Lleida. Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques |
| Publisher | Universitat de Lleida |
| Source Sets | Universitat de Lleida |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0026 seconds