The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 μm/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of β1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications. / Die zyklischen Nukleotide cAMP and cGMP sind zwei ubiquitäre Botenstoffe, die verschiedene physiologische Prozesse regulieren, vom Sehen und Gedächtnis bis zu Blutdruck und Thrombusbildung. Sie wirken über cAMP- und cGMP-abhängige Kinasen (PKA und GK), Kanäle und Epac. Obgleich die Funktionen von zyklischen Nukleotiden in klassischen biochemischen Studien gut untersucht sind, ermöglichen diese Methoden nicht, cAMP und cGMP in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu analysieren. In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzresonanzenergietransfer benutzt, um eine Technik für die Visualisierung von cAMP and cGMP in lebenden Zellen und in vitro zu entwickeln. Ligand-induzierte Konformationsänderung in einer einzelnen, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierten Bindungsdomäne diente als Grundlage für Biosensoren, die dynamische, hochsensitive Messungen von cAMP und cGMP ermöglichen. Bei solchen Sensoren wurden die chemischen und Bindungseigenschaften von unmodifizierten Domänen aufrechterhalten, was die cAMP- und cGMP-Messungen im physiologischen Konzentrationsbereich in lebenden Zellen ermöglicht. Für die Entwicklung der cAMP-Sensoren wurden die Domänen von PKA, Epac und von einem cAMP- gesteuerten HCN-Kanal benutzt. cGMP-Sensoren beruhen sich auf den Bindungsdomänen von GK und Phosphodiesterasen (PDEs). Mit Hilfe der auf Epac-basierten Sensoren wurde die cAMP-Dynamik in Neuronen und Makrophagen zeitlich und räumlich aufgelöst. In diesen Zellen diffundiert cAMP mit hoher Geschwindigkeit (~ 40 μm/s) frei durch das ganze Zytosol. Um die Mechanismen der cAMP-Kompartimentierung besser zu verstehen, wurden die kinetischen Eigenschaften der PDE2 in aldosteronproduzierenden Zellen analysiert. PDE2 ist imstande, große Mengen von cAMP äußerst schnell zu hydrolisieren, so dass die Geschwindigkeit der cAMP-Hydrolyse viel höher ist als von cAMP-Synthese, was eine Grundlage der cAMP-Kompartimentierung sein könnte. cAMP-Sensoren wurden auch benutzt, um eine klinisch relevante diagnostische Methode zu entwickeln, die Autoantikörper gegen β1-adrenergen Rezeptoren bei Herzinsuffizienzpatienten zuverlässig nachweist. Diese Methode hat ermöglicht, die Sensitivität der früher entwickelten Techniken zu verbessern. Konformationsänderung in einzelnen Bindungsdomänen von GK und PDE wurde als nächstes benutzt, um ein Reihe neuer fluoreszierender Biosensoren für cGMP zu entwickeln. Diese Sensoren zeigten hohe räumliche und zeitliche Auslösung und wurden zur Analyse schneller Dynamik von cGMP-Synthese und für cGMP-Imaging in Mesangialzellen angewandt. Zusammenfassend wurden hochsensitive Biosensoren für cAMP und cGMP auf Grund einzelner, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierter Bindungs-domäne entwickelt und in verschiedenen biologischen und klinisch relevanten Applikationen eingesetzt.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1631 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Nikolaev, Viacheslav |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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