A TPases do tipo P são proteínas integrais de membrana que usam a energia química contida na molécula de ATP para o transporte de cátions através de membranas. O nosso trabalho apresenta a clonagem e o sequenciamento de um gene (BePAT2) e a caracterização da expressão de dois genes (BePAT1 e BePAT2) codificando isoformas de uma ATPase do tipo P no fungo aquático Blastocladiella emersonii. As proteínas codificadas por estes genes, surpreendentemente se mostraram mais similares às Na+/K+ e H+/K+-ATPases de eucariotos superiores do que a outras ATPases de fungos. Experimentos de \"Northern blot\", imunoprecipitação e \"Western blot\" demonstraram que as ATPases (BePAT1 e BePAT2) são diferencialmente expressas durante o desenvolvimento de B. emersonii. Os resultados obtidos mostraram que o aumento da transcrição dos genes refletiu em um aumento da síntese e do acúmulo das ATPases, sugerindo um controle pré-traducional da expressão de BePAT1/2. Estudos de formação de fosfoenzima na presença de diferentes íons e inibidores, utilizando as enzimas imunopurificadas, sugerem que as proteínas codificadas por estes genes tenham uma atividade semelhante às Na+/K+-ATPases. Os nossos resultados de expressão e atividade mostram pela primeira vez, evidências da funcionalidade de genes codificando uma proteína similar às Na+/K+-ATPases em um eucarioto inferior. / P- type A TPases are integral membrane proteins which use the energy stored in the A TP molecule to drive the transport of cations through biological membranes. In this work we report the cloning and sequencing of the BePAT2 gene and the characterization and expression of two genes (BePAT1 and BePAT2) encoding isoforms of a P-Type ATPase in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Surprisingly the putative BePAT1 and BePAT2 proteins are more similar to Na+/K+and H+/K+-ATPases from animal cells than to other P-type ATPases from fungi. Northern blot, immunoprecipitation and Western blot experiments demonstrated that these ATPases (BePAT1 and BePAT2) are developmentally regulated in B. emersonii. The results showed that the increase in the BePAT1/2 transcription reflects in an increase in the synthesis and accumulation of the proteins, suggesting a transcriptional control of the BePAT1/2 expression. Studies of phosphoenzyme formation using the immunopurified enzymes in the presence of different ions and inhibitors suggested a Na/K-ATPase like activity. Our results demonstrate for the first time biochemical evidences of functionality of genes encoding a Na+ /K+-ATPase like protein in an eucaryotic microorganism.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23012019-100954 |
| Date | 23 March 2001 |
| Creators | Fietto, Luciano Gomes |
| Contributors | Gomes, Suely Lopes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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