La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie dévastatrice récessive liée au chromosome X. Cette pathologie est due à la présence de mutations dans le gène DMD codant pour la dystrophine. Le rôle de cette protéine est encore l’objet de nombreuses interrogations et elle pourrait être impliquée dans le développement de la DMD in utero. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) traitées par le BMP4 (bone morphogenetic protein 4) nous ont permis d’étudier les premières étapes de la myogenèse dans un contexte normal et DMD.De façon inattendue, les hPSCs traitées par le BMP4 expriment un transcrit long DMD à un niveau similaire à celui observé dans le muscle squelettique adulte. Ce transcrit possède un exon 1 spécifique et non traduit identifié par 5’RACE PCR dont la séquence est conservée uniquement dans un sous-groupe d’anthropoïdes comprenant l’Homme. L’isoforme de la dystrophine correspondante est caractérisée par un domaine tronqué de fixation à l’actine à l’extrémité N-terminale. Cette protéine de 412 kD a été détectée par Western blot dans des hPSCs normales traitées par le BMP4 ainsi que dans des corps embryoïdes. Suite à des analyses extensives démontrant que son expression était restreinte aux toutes premières étapes de la différenciation, cette nouvelle isoforme a été nommée ‘Dp412e’.Cette étude valide l’utilisation des hPSCs pour analyser les étapes précoces du développement humain dans un contexte normal et pathologique et a conduit à la découverte d’une nouvelle isoforme embryonnaire humaine de la dystrophine de 412 kD. L’étude de la régulation et des fonctions associées à cette nouvelle isoforme contribuera à mieux comprendre la physiopathologie de la DMD et les défauts développementaux potentiels. Le modèle inductible par le BMP4, simple, rapide et robuste, procurant une grande quantité de transcrits longs DMD et la protéine correspondante, est déjà bien adapté aux approches de criblage à haut débit et à haut contenu. Une première preuve d’efficacité de ce modèle a d’ailleurs été réalisée avec succès grâce à une modification par saut d’exon du transcrit Dp412e. La disponibilité de cette plateforme cellulaire performante accéléra le développement, la validation et l’amélioration de thérapies géniques DMD. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a devastating X-linked recessive genetic myopathy. This pathology is caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin. Many questions remain about the role of this protein and it could be implicated in the DMD onset in utero. Human pluripotent stem cells (hPSCs) together with the bone morphogenetic protein 4 (BMP4), allowed us to study the early steps of myogenesis in normal and DMD contexts. Unexpectedly, a new long DMD transcript was detected in BMP4-treated hPSCs at levels similar to that found in adult skeletal muscle. This novel transcript had a specific untranslated first exon identified by 5’RACE PCR which was conserved only in a sub-group of anthropoids including Human. The corresponding novel dystrophin protein is characterized by a truncated N-terminal actin-binding domain. This isoform of 412 kD was detected by Western blot in normal BMP4-treated hPSCs and also in embryoid bodies. Following extensive analyses demonstrating that its expression is restricted to the first stages of differentiation, this transcript was named 'Dp412e’. This study validates the use of hPSCs to analyze early phases of human development in normal and pathological contexts and has led to the discovery of a new human embryonic 412 kD dystrophin isoform. Deciphering the regulation process(es) and the function(s) associated to this new isoform will contribute to a better understanding of the DMD physiopathology and potential developmental defects. The simple, fast and robust BMP4-inducible model highlighted here providing large amount of a long DMD transcript and the corresponding protein, is already well-adapted to high-throughput and high-content screening approaches. As a first proof of concept, an exon skipping modification of Dp412e transcript was successfully done with this model. Availability of this powerful cell platform will accelerate the development, validation and improvement of DMD genetic therapies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015SACLE008 |
| Date | 01 December 2015 |
| Creators | Massouridès, Emmanuelle |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Pinset, Christian |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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