A coqueluche é uma doença respiratória contagiosa, causada pela bactéria Bordetella pertussis. Tendo um significativo impacto epidemiológico, esta doença sofreu uma expressiva redução após o uso disseminado de vacinas pertussis. Efeitos adversos na imunização com a Vacina de células inteiras Whole cell pertussis (wP), atribuídos a presença de lipopolissacarídeos (LPS), levou ao desenvolvimento da Vacina pertussis acelular (aP). Contudo, a imunização com aP não tem demonstrada a mesma eficiência que a imunização com wP. Diante desse cenário o objetivo deste trabalho é desenvolver o processo de produção industrial de uma nova Vacina Pertussis de células inteiras com reduzida quantidade de LPS e baixa reatogenicidade, a Vacina Pertussis Low (wPlow). Para alcançar o objetivo, foram produzidos em escala industrial 25 lotes de cultivos inativados, concentrados e submetidos à extração de LPS com solvente orgânico. Para extração de LPS foram avaliadas 4 diferentes metodologias: filtração de fluxo tangencial (TFF); filtração de fluxo tangencial com lavagem com solução com solvente orgânico (TFFSW); centrifuga tubular (CT); centrifugação de fluxo contínuo de pratos (CFC). A wPlow produzida em centrifuga de bancada e a wP foram usadas para comparação. O processo de bancada resultou na redução de LPS (método Purpald) em média de 75% do conteúdo de LPS e a redução de 81% da atividade endotóxica (dosagem de LAL). Nos processos industriais, por TFF houve a redução de ≅21% do conteúdo de LPS, porém com aumento de ≅ 52% da atividade endotóxica; por TFFSW houve a redução de 46% do conteúdo de LPS e uma redução endotóxica média de ≅ 24%; por CT ocorreu à redução de ≅ 66% do conteúdo de LPS e de ≅ 73% da atividade endotóxica; com a CFC houve a redução de ≅ 92% do conteúdo de LPS e de ≅ 61% da atividade endotóxica. Os rendimentos de processo foram ≅ 83%, 61%, 37% e 63% respectivamente para os processos de TFF, TFFSW, CT e CFC. Através de microscopia eletrônica, foi possível visualizar a integridade celular após o processamento por CFC, e o principal antígeno vacinal, a toxina pertussis foi detectada na preparação, por western-blot. Quanto à imunogenicidade, anticorpos IgG anti-pertussis foram detectados por ELISA e resultados preliminares não mostraram diferença significativa de redução de colonização pulmonar de B. pertussis em camundongos imunizados com a wPlow ou wP. Diante dos resultados obtidos, podemos concluir que os processos de TFF e TFFSW não foram eficientes na remoção da atividade endotóxica da wPlow, embora tenha ocorrido a redução do LPS. Com relação aos processos utilizando centrífugas industriais, eficientes tanto na remoção do LPS e na redução da atividade endotóxica, houve, contudo, um baixo rendimento no processo com CT. A wPlow produzida por CFC foi imunogênica, indicando a eficácia potencial desta vacina e que a produção em escala industrial é um processo viável. Como parte deste trabalho, a cepa vacinal de Bordetella pertussis foi também caracterizada pelo seu sequenciamento genômico completo (genbank número CP010323). / Whooping cough is a contagious respiratory disease caused by Bordetella pertussis. In the past this infection had a high epidemiological impact, only reduced after the use of pertussis vaccine. The association of adverse events in immunization with whole cell Pertussis vaccine (wP), attributed to the presence of lipopolysaccharides (LPS), has led to the development of acellular Pertussis vaccine (aP). However, it is known that immunization with aP does not have the same efficiency as compared to immunization with wP vaccine. In this scenario, the objective of this work is to develop the industrial production process of a new whole cell pertussis vaccine with reduced amount of LPS and low reatogenicity, the whole cell Pertussis low vaccine (wPlow). To achieve this aim, we produced 25 lots of inactivated and concentrated cultures prepared on an industrial scale and subjected to LPS extraction with organic solvent. We evaluated four industrial processes to extract the LPS from the cells: tangential flow filtration (TFF), TFF with organic solvent washing (TFFSW), tubular centrifugation (CT) and continuous flow centrifugation (CFC). These methodologies were compared with wPlow produced at bench scale obtained by centrifugation and with traditional wP. The bench process resulted in the reduction of 75% of LPS content (Purpald method) and 81% reduction in endotoxic activity (LAL dosage) on average. In the industrial processes, TFF reduced ≅ 21% in LPS content, but with a ≅52% increase in endotoxic activity; by TFFSW there was a reduction of ≅ 46% of the LPS content and an average reduction of endotoxic activity of ≅24%; CT reduced ≅ 66% of LPS content and ≅ 73% of endotoxic activity; with CFC there was a reduction of ≅ 92% in LPS content and ≅1% in endotoxic activity. The process yields were ≅ 83%, 61%, 37% and 63% respectively for the TFF, TFFSW, CT and CFC processes. Through electron microscopy, it was possible to visualize cell integrity after CFC processing, and the major vaccine antigen, pertussis toxin, was detected in the preparation by western blot. As for immunogenicity, anti-pertussis IgG antibodies were detected by ELISA and preliminary results showed no differences in the B. pertussis colonization of lungs in mice immunized with wPlow or wP. We can conclude that the TFF and TFFSW processes were not efficient in removing the endotoxic activity of wPlow, although LPS reduction occurred. Although the processes using industrial centrifuges were efficacious in the removal of LPS and in the reduction of endotoxic activity, there was a low yield in the CT process. The wPlow produced by CFC was immunogenic indicating its potential as a vaccine and that this industrial scale production is a viable process. The characterization of the vaccine strain of Bordetella pertussis by complete genome sequencing was also presented here as part of this work (genbank - number CP010323).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03122018-113431 |
| Date | 13 April 2018 |
| Creators | Akamatsu, Milena Apetito |
| Contributors | Ho, Paulo Lee |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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