O seqüenciamento em larga-escala e a aplicação da tecnologia de seqüências expressas (ESTs) permitiram a identificação de milhares de seqüências genômicas de vários organismos. Através de projetos como o de obtenção de ESTs de cana-de-açúcar (SUCEST Sugarcane EST Project), a tecnologia de macro e microarranjos de DNA pôde ser aplicada para o monitoramento da expressão gênica. O primeiro passo deste trabalho foi otimizar a técnica de macroarranjos utilizando-se colônias bacterianas. Os arranjos foram construídos com o auxílio do robô Q-Bot. Células bacterianas contendo clones de cDNA de cana-de-açúcar foram arranjadas em duplicata em membranas de náilon e crescidas por 6 e 12 horas. Como resultado, concluiu-se que é possível estudar a expressão gênica em larga-escala usando macroarranjos de colônias bacterianas crescidas por 6 horas. Na segunda parte, o objetivo foi identificar genes de defesa em duas variedades de cana-de-açúcar (Saccharum sp.), em resposta ao herbívoro Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). A cana-de-açúcar é de grande importância para a agricultura brasileira e para a economia geral de muitos países em desenvolvimento. Estas plantas são atacadas por D. saccharalis, a mais importante praga desta cultura, causando significativas perdas econômicas. Como é sabido, as plantas desenvolveram complexas estratégias para se protegerem do ataque de insetos-praga. As variedades SP80-3280 (susceptível) e SP81-3250 (tolerante) de cana-de-açúcar foram expostas à D. saccharalis. Plantas submetidas à lagarta e plantas controle foram coletadas em 0.5, 6, 12 e 24 horas de experimento. As análises permitiram a identificação de genes diferencialmente expressos em resposta à lagarta nas duas variedades. Foram analisados o tempo, dinâmica e regulação da expressão de 3.840 clones do SUCEST, os quais foram crescidos na membrana de náilon por 6 horas. Estes ESTs foram agrupados em dezesseis classes: metabolismo de aminoácidos, crescimento/desenvolvimento, metabolismo de proteínas, metabolismo de RNA, metabolismo secundário, resposta à diferentes condições de estresse, transporte, bioenergética, transdução de sinal, dinâmica celular, metabolismo de DNA, metabolismo de lipídios, elementos móveis, metabolismo de nitrogênio, sulfato e fosfato, metabolismo de nucleotídeos e função não determinada (ND). Estes resultados ajudam elucidar as estratégias de defesa desenvolvidas pela cana-de-açúcar para evitar os danos causados por esta praga. Neste estudo, os dados do macroarray revelaram 580 ESTs com expressão aumentada, oriundos das duas variedades. Estes resultados são importantes não somente porque este é o primeiro estudo em larga-escala da expressão gênica de uma monocotiledônea em resposta ao ataque de herbívoros, mas também porque permite a comparação dos perfis de expressão entre genótipos susceptível e tolerante de cana-de-açúcar. Este estudo abre possibilidades para a engenharia genética de plantas de cana-de-açúcar inseto-resistentes e também para o uso destes genes como marcadores moleculares em programas de melhoramento assistido. / Large-scale sequencing and the application of expressed sequence tag (EST) technology has led to the identification of hundreds of thousands of genomic sequences from various organisms. Through projects like the Sugarcane Expressed Sequence Tag (SUCEST), DNA arrays technology could be applied in monitoring gene expression. The first step of this work was to optimize the macroarray technique with bacterial colonies. Arrays were robotically constructed (Q-Bot). Bacterial cells carrying sugarcane cDNA clones were arrayed in duplicate onto nylon membrane and grown for 6 and 12 hours. As a result, we conclude that is possible to study the gene expression in large-scale using macroarray through bacterial colony that grown for 6 hours. The second part of this work was to study how different two sugarcane varieties (Saccharum sp.) are in response resistance against Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Sugarcane is of great importance for Brazilians agriculture and for the general economy of many tropical developing countries. These plants are attacked by D. saccharalis, the most important insect pest of sugarcane, causing significant economic losses. As it is well known, plants have evolved complex defense strategies to protect them in opposition to attack by insects. The varieties SP80-3280 (susceptible) and SP81-3250 (tolerant) were exposed to D. saccharalis. Plants materials from plants with the borer and control plants (without the borer) were collected at 0.5, 6, 12 and 24 hours time points. The analysis revealed genes differentially expressed in response to sugarcane borer in both varieties. We analyzed the timing, dynamics, and regulation of the expression of 3,840 SUCEST clones, which were grown on a nylon membrane for 6 h. These ESTs was grouped into 16 broad categories: amino-acid metabolism, plant grow and development, protein metabolism, RNA metabolism, secondary metabolism, stress response, transport, bioenergetics, signal transduction, cellular dynamics, DNA metabolism, lipid, fatty-acid metabolism, mobile genetic elements, nitrogen, sulphur and phosphate metabolism, nucleotide metabolism, and the group matched to unable to classify, which no indication of the function of the gene product are known. These results help to elucidate the defense strategies developed by sugarcane in order to prevent against insect damage. In this study, macroarray analyses revealed 580 ESTs with increased expression, from both varieties. These results are important not only because this is the first large-scale gene expression study of a monocot in response to insect attack, but also because it allows the comparison of the gene expression pattern between susceptible and tolerant genotypes. This study opens possibilities for genetically-engineering of insect-resistant sugarcane and for using these genes as molecular markers in conventional breeding programs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-22112004-145719 |
| Date | 03 September 2004 |
| Creators | Carla Fernanda Barsalobres |
| Contributors | Marcio de Castro Silva Filho, Daniel Scherer de Moura, Marcelo Menossi Teixeira |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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