A crescente demanda clínica para regeneração óssea tem dirigido esforços significativos para o desenvolvimento de novos biomateriais, incluindo aqueles aplicados em terapias baseadas em engenharia de tecidos. Neste contexto, os biovidros são considerados uma boa alternativa mas as suas propriedades mecânicas têm limitado a sua aplicação. Para melhorar tais propriedades sem afetar a biocompatibilidade, um novo material vitrocerâmico bioativo do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, chamado Biosilicato® com duas fases cristalinas (BioS-2P) foi desenvolvido. No entanto, os efeitos da adição das fases cristalinas sobre o comportamento biológico do BioS-2P ainda não foram estudados. Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a capacidade do BioS-2P em induzir, in vitro, a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (CTMs); a capacidade do BioS-2P em aumentar, in vitro, a atividade dos osteoblastos em fase inicial de diferenciação (OBs) e osteoblastos da linhagem UMR-106 (UMRs); e a capacidade do BioS-2P em conduzir e induzir a neoformação óssea, in vivo, associado ou não a células. Células derivadas da medula óssea obtidas de fêmures de ratos foram cultivadas em meio de crescimento para obtenção de CTMs ou em meio osteogênico para obtenção de OBs. Essas células e UMRs foram cultivadas sobre discos de BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) e plástico de cultura (Controle) e utilizadas nas avaliações in vitro. Para as avaliações in vivo, defeitos de 5 mm criados em calotas de ratos foram implantados somente com arcabouços de BioS-2P ou com arcabouços de BioS-2P associados às CTMs ou aos OBs. Os dados foram comparados por teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Student Newman-Keuls, e o nível de significância adotado foi de 5%. As CTMs foram caracterizadas por apresentarem alta porcentagem de células expressando os marcadores de superfície CD29 e CD90 e baixa porcentagem expressando CD31, CD34, CD45 e CD106. A diferenciação osteoblástica das CTMs foi confirmada pela expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcriptor factor-2 (RUNX2), sialoproteína óssea (BSP) e osteocalcina (OC). CTMs cultivadas sobre discos de BioS-2P em meio não-osteogênico apresentaram diminuição da proliferação e aumento da atividade de ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, osterix (OSX), proteína óssea morfogenética-4 (BMP-4), osteopontina (OPN) e OC, comprovando seu potencial osteoindutor similar ao 45S5. O BioS-2P foi capaz de aumentar a atividade de OBs e UMRs de maneira similar àqueles cultivados sobre o 45S5. OBs apresentaram diminuição na proliferação e aumento da atividade da ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica RUNX2, OSX, BMP-4, OPN e OC. A análise em larga escala da expressão de mais de 23.000 genes mostrou que o BioS-2P induziu a sobre-expressão de genes envolvidos no aumento da atividade osteoblástica e a repressão de genes envolvidos na diminuição dessa atividade, em comparação com o Controle. Ao menos em parte, esse aumento da atividade osteoblástica foi atribuído à modulação das vias de sinalização proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e Wnt Canônica, e à modulação da expressão de microRNAs. UMRs crescidos sobre o BioS-2P corroboraram esses achados, pela capacidade em formar matriz mineralizada e por apresentarem aumento na expressão das proteínas ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) e OPN. Arcabouços de BioS-2P (5 mm de diâmetro e 2 mm de altura com porosidade de 76 ± 5% e com tamanhos de poros variando entre 100 e 800 µm) implantados em defeitos na calota de ratos estimularam a formação de tecido ósseo, que ocorreu tanto na periferia como no interior dos defeitos e em íntimo contato com o material. A morfometria por microtomografia computadorizada não evidenciou qualquer diferença entre os parâmetros volume ósseo, volume ósseo/volume total, superfície óssea, superfície/volume ósseo, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, avaliados na 4a, 8a e 12a semanas de implantação. As CTMs e os OBs foram carreados para os arcabouços de BioS- 2P (com eficiência de 90% e 81%, respectivamente) e essas células permaneceram nos defeitos por 14 dias. A combinação de arcabouços de BioS-2P com CTMs ou OBs, implantados por 8 semanas, resultou no mesmo padrão de formação óssea daquele observado para o arcabouço sem células. No entanto, essa combinação não resultou em aumento na quantidade de osso formado. Os resultados evidenciaram a capacidade do BioS-2P em induzir a diferenciação osteoblástica de CTMs e estimular a atividade osteoblástica de OBs, o que resultaria na neoformação óssea observada in vivo. No entanto, a combinação de BioS-2P com CTMs e OBs não foi capaz de aumentar a formação óssea e induzir o reparo dos defeitos ósseos. / The increasing clinical demand for bone regeneration has driven significant efforts to develop new biomaterials including those for tissue engineeringbased therapies. In this context, bioglasses emerges as a good alternative, but their use has been limited mainly due their poor mechanical properties. To improve these mechanical properties without affecting biocompatibility, a novel bioactive glass-ceramic of the P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system, named Biosilicate® with two cristallyne phases (BioS-2P) was developed. However, the effects of these two phases on BioS- 2P biological behavior have not yet been evaluated. Thus, the aims of this study were to investigate the BioS-2P capability of inducing in vitro mesenquimal stem cell differentiation (MSC) towards osteoblasts; the BioS-2P capability to increase in vitro activity of osteoblasts derived from rat bone marrow at early stages of differentiation (OBs) and osteoblasts from rat cell line UMR- 106 (UMRs); and the BioS-2P capability to drive and induce bone formation in vivo, associated or not with cells. Bone marrow cells harvested from rat femurs were cultured either in growth media to obtain MSCs or in osteogenic media to obtain OBs. MSCs, OBs and UMRs were cultured on discs of BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) and tissue culture polystyrene (Control). For in vivo evaluations, 5-mm rat calvarial surgical defects were filled with BioS-2P with or without MSCs or OBs. Data were compared by non-parametric Kruskal-Wallis test followed by Student Newman- Keuls test and the significance level was set at 5%. MSCs were characterized by presenting high percentage of CD29 and CD90 surface markers and low percentage of CD31, CD34, CD45 and CD106 surface markers. Osteoblastic differentiation of MSCs was detected by gene expression of bone markers alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcritption factor 2 (RUNX2), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). MSCs cultured on Bios-2P discs under non-osteogenic conditions exhibited a decrease on cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers ALP, RUNX2, osterix (OSX), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), osteopontin (OPN) and OC, confirming its osteoinductive potential similar to 45S5. Also, BioS-2P increased the OBs and UMRs activity, similar to 45S5. OBs cultured on Bios-2P discs presented a decrease in cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers RUNX2, OSX, BMP-4, OPN and OC. The large-scale analysis of over 23,000 genes showed that the BioS-2P induced overexpression of genes positively related to osteoblastic activity and repression of genes negatively related with its activity, compared with control. At least in part, the increase on OBs activity was associated to the modulation of two main signaling pathways, the mitogen activated protein kinases (MAPK) and the Canonical Wnt, and the modulation of microRNAs expression. These findings were corroborated by UMRs grown on BioS-2P, which produced mineralized matrix and exhibited increased expression of the ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) and OPN proteins, than on control. BioS-2P scaffolds (5 mm diameter and 2 mm heigh, presenting 76 ± 5% of total porosity, with poros size ranging from 100 to 800 µm) implanted in calvarial defects promoted new bone formation in close contatc to BioS-2P, both on periphery and in the center of the defect. The computed microtomography morphometry showed no difference between the evaluated parameters bone volume, bone volume / total volume, bone surface, surface / bone volume, number of trabeculae, trabecular separation and trabecular thickness, measured at 4, 8 and 12 weeks. MSCs and OBs were seeded into the scaffold (with efficiency of incorporation 90% e 81%, respectively) and they remained on the defects for 14 days. After 8 weeks, the same pattern of bone formation was observed, however, the combination of BioS-2P with cells did not increase the amount of new bone. The results showed the BioS-2P ability to induce osteoblastic differentiation of MSCs and to stimulate osteoblastic activity, resulting in new bone formation in vivo. However, the combination of BioS-2P with MSCs and OBs was not able to increase bone formation and induce the repair of bone defects.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-23092016-154149 |
| Date | 02 September 2016 |
| Creators | Emanuela Prado Ferraz |
| Contributors | Adalberto Luiz Rosa, Márcio Mateus Beloti, Maria Helena Raposo Fernandes, Roberta Okamoto |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Odontologia (Periodontia), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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