O presente trabalho relata a identificação de áreas neurogênicas, o cultivo, identificação e caracterização de precursores neurais obtidos do encéfalo de fetos de cobaias. Áreas potencialmente neurogênicas no encéfalo de neonatos foram identificadas por imunohistoquímica para a bromodeoxiuridina (BrdU), após inoculação da droga. A incorporação de BrdU foi detectada principalmente em células das áreas subjacentes ao ventrículo lateral, hipocampo e bulbo olfatório, indicando proliferação celular e sugerindo o potencial neurogênico dessas áreas. A seguir, realizou-se o cultivo de precursores neurais a partir da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais. Após aproximadamente uma semana de cultivo, as células da SVZ em multiplicação ativa originaram abundantes massas celulares (neuroesferas, NSFs). Células dissociadas a partir das NSFs primárias foram capazes de gerar novas neuroesferas após alguns dias de cultivo. As NSFs proliferaram em número e em tamanho, podendo ser subcultivadas por até 5-6 passagens, com intervalos de uma semana, permanecendo viáveis por até 60 dias. Nesse período, as NSFs foram congeladas e descongeladas, tendo sido preservadas a sua viabilidade e capacidade proliferativa. Ensaios de viabilidade pelo método colorimétrico de MTT revelaram diferenças de viabilidade entre NSFs cultivadas a partir de SVZs de animais de diferentes idades (fetos, 7, 30 e 180 dias de vida). NSFs dissociadas apresentaram cerca de 2,3% de morte celular por apoptose e cerca de 3,1% de morte por necrose. NSFs íntegras e dissociadas foram submetidas a imunofluorescência (IF), utilizando-se anticorpos para marcadores de células-tronco (nestina), neurônios (Beta-III-tubulina), oligodendrócitos (mGALC) e astrócitos (GFAP). Marcação difusa, de intensidade variável, foi observada no citoplasma de células das NSFs e nas células individualizadas, mas o percentual de células expressando os diferentes marcadores não foi determinado. Quando cultivadas em meio contendo B27, sem fatores de crescimento, as NSFs apresentaram evidências de diferenciação, originando células aderentes a superfície do frasco, com características morfológicas diferentes as das NSFs, indicando diferenciação. Citometria de fluxo de células das NSFs após a diferenciação revelou 13,3% positivas para nestina, aproximadamente 5,5% positivas para beta-III-tubulina, 9% positivas para GFAP e 7,8% positivas para mGalC. Células diferenciadas foram então submetidas a teste de funcionalidade, pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato. A adição de GABA e glutamato resultou em estimulação de algumas células diferenciadas, que foi observado por meio do aumento da fluorescência das mesmas. Portanto, células cultivadas e diferenciadas in vitro a partir da SVZ de fetos de cobaias apresentam indicadores funcionais de neurônios. A capacidade das células da SVZ de fetos cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora no sentido de aprofundar as pesquisas e viabilizar o uso terapêutico de células-tronco em disordens do sistema nervoso. / The present study concerns the identification of neurogenic areas, culture, identification and characterization of neural precursors obtained from the brain of guinea pigs. Potentially neurogenic areas in the brain of neonates were identified by immunohistochemistry for bromodeoxyuridine (BrdU), following administration of the drug. BrdU incorporation was detected mainly in cells underlying the lateral ventricle, in hippocampus and olfactory bulbs, indicating cell proliferation and suggesting a neurogenic potential for these areas. Subsequently, neural precursors were cultured from cells obtained from the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. After approximately one week culture, SVZ cells in active multiplication originated abundant cellular masses (neurospheres, NSFs). Cells dissociated from primary NSFs were capable of originating new NSFs after a few days of culture. NSFs proliferated in number and size, allowing 5-6 weekly subculturings and maintaining growth and viability for up to 60 days. In the meantime, NSFs were frozen and thawed, maintaining the viability and proliferative ability. Viability assays by the colorimetric MTT revealed viability differences among NSFs originated from SVZs from animals of different ages (fetuses, 7, 30 and 180 days of age). Dissociated NSFs underwent approximately 2.3% cell death by apoptosis and 3.1% death by necrosis. Intact and dissociated NSFs were submitted to immunofluorescence (IF), using antibodies for cell markers of stem cells (nestin), neurons (beta-III tubulin), oligodendrocytes (mGalC) and astrocytes (GFAP). A diffuse staining of variable intensity was observed in the cytoplasm of NSFS and dissociated cells, yet the rate of cells expressing each individual marker could not be determined. Upon culture in medium containing B27, without NSFs-specific growth factors, NSFs displayed evidence of neural differentiation, originating cells with morphology distinct from that of NSFs, suggesting differentiation. Flow cytometry analysis of NSFs cells after differentiation revealed approximately 13.3% positive for nestin, around 5.5% positive for beta-III-tubulin, 9% GFAP positive and approximately 7.8% positive for mGalC. Differentiated cells were then submitted to a functional test, by measuring calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli. GABA and glutamate stimulated some differentiated cells. Thus, cells cultured and differentiated from guinea pig SVZ present physiological indicators of neuronal physiology. Thus, the ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising towards further studies and potential therapeutic use of neural stem cells in disorders of the nervous system.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04072013-120221 |
| Date | 18 December 2012 |
| Creators | Fonseca, Erika Toledo da |
| Contributors | Miglino, Maria Angélica |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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