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Sinalização de morte celular via NA+, K+-ATPase como alvo de drogas anticâncer: estudos com o álcool perílico

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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Na+, K+ ATPase (NKA) atua na manutenção do potencial de membrana das células e em mecanismos de transdução de sinal. Alterações na atividade da NKA são importantes em muitos processos biológicos e patológicos. A NKA pode ser inibida pelo álcool perílico (POH), um monoterpeno utilizado no tratamento de tumores, incluindo cerebrais. Neste trabalho, determinamos que o POH também atua sobre cascatas de sinalização, moduladas via NKA, que controlam a proliferação e/ou morte celular. Foi avaliado o efeito do POH e do PA seu principal metabólito, sobre a atividade da NKA em duas linhagens de células de glioblastoma (GBM) humano (U87 e U251), células não tumorais de astrócitos de camundongo e da linhagem (VERO). Nossos resultados, baseados na avaliação da atividade da NKA por incorporação do Rb+, o qual mimetiza o K+, mostraram uma sensibilidade à inibição pelo POH semelhante entre os quatro tipos de células (IC50 U87 2 mM; U251 1,8 mM; VERO 2,4 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM), enquanto o PA não apresentou efeito. Sabe-se que nos GBMs existe uma superexpressão da subunidade \03B11 da NKA, situada na estrutura das cavéolas que é provavelmente responsável pelo papel sinalizador atribuído a essa enzima, especialmente em relação aos mecanismos apoptóticos. Comparamos a viabilidade celular, determinando a atividade da enzima lactato desidrogenase presente no sobrenadante das células tratadas por 24 h com POH e PA
O PA não alcançou efeito citotóxico igual ou superior a 30% nas células mesmo na concentração elevada de 4 mM. Já o POH reduziu, de maneira dependente da concentração, a viabilidade das células (IC50 U87 1,1 mM; U251 1,4 mM; VERO 0,9 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM). Na análise por western blot, 1,5 mM de POH ativou a proteína c-Jun N-terminal quinase (JNK), nas células U87, U251 e nos astrócitos de camundongo (incubação de 30 min). O uso do inibidor Src quinase (dasatinibe) e a depleção colesterol da membrana celular com metil \03B2-ciclodextrina reduziram a ativação da JNK1/2 induzida pelo POH nas células U87, indicando a possível participação do complexo NKA-Src (presente nas cavéolas), nesta via de sinalização. POH (1,5 mM) aumentou a liberação da interleucina IL-8, detectada por ELISA, no sobrenadante das células U251 (24 h incubação), indicando possível estratégia destas células para evitar o efeito citotóxico do POH. Resultados obtidos com citometria de fluxo mostram que a inibição da JNK1/2 (pelo inibidor JNK V) reduz a apoptose ocasionada pelo POH nas células de GBM, indicando o envolvimento desta proteína na morte celular programada. Os resultados obtidos mostram que o mecanismo de sinalização celular mediado pela NKA pode ter um importante papel no mecanismo de ação antitumoral do POH em células de GBM / The Na
+
, K
+
ATPase
(NKA) acts in keeping the cell membrane potential
and in signal
transduction mechanisms
. Modifications in the
activity of this enzyme are important in
physiological and patholog
ical processes. The
NKA
is inhibited by perillyl a
lco
h
ol
(POH), a
monotherpene
used in the treatment of tumors, including brain tumors.
In
this work
,
we also show
that POH act
s
in signal
ing cascades associated to NKA,
controlling cell proliferation and/or
cellular death. We evaluated the effect of POH and
o
f its main metabolite (peri
l
lic acid
-
PA) on the NKA a
ctivity in cultured glioblastoma
cells
(
GBM)
U87
and
U251 and on non
-
tumor cells (mouse astrocytes and VERO
cells)
.
N
AK activity was measured by non
-
radioactive Rb
+
incorporation
by cells
(Rb
+
is a K
+
substitute). Our results showed a similar sensitivity for the four cells types
tested
(IC
50
U87

2
mM; U251
-
1,8
mM; VERO
-
2,4
mM and mouse
astrocy
tes
-
1,4
mM). Peri
l
lic acid did no
t show any effect i
n any cell type.
In GBMs
,
it is known
that NKA
α
1
subunit is super
expressed. Thi
s isoform is embedded in caveolar
structures and is probably responsible by the signaling properties of this enzyme in
apoptosis mechanisms.
Cell viability was
measured by lactate dehydr
o
genase in cell
supernatants of
POH
treated cells. The maximum PA cy
totoxic effect
obtained
was
30% even at 4
mm.
However,
POH
reduced dose dependently
cell
viability
, (IC
50
U87
-
1,1
mM; U251
-
1,4
mM
; VERO
-
0,9
mM and
mouse astrocyte
-
1,4
mM).
Considering the western blot analysis, 1,5
m
M POH activated the
c
-
Jun N
-
terminal
K
inase (JNK),
on
U87,
U251 and in mouse astrocy
tes
after
30min incubation
.
D
a
satinib (an inhibitor of
Src
K
inase) and methyl
β
-
ci
clodextrin
(which promotes
cholesterol depletion in
cell membrane
s
) reduced JNK
1/2
activation induced by POH
in U87 cells, indicating the participation of NKA
-
Src
comp
lex seen in caveolar
structure
in this mechan
ism.
1,5mM
POH
a
fter 24h incubation incr
ease interleuk
in IL
-
8 in U251 cell supernatant, and this may indicate a possible strategy to avoid the
cy
totoxic effect of POH.
Results obtained by flux cy
tometry
showed
that
the
inhibition
of
JNK1/2
(by the inhibitor JNK
V) reduced apoptosis consequent to
POH
administration in GBM cells, indicating the involv
e
ment of this protein in
programmed
cellular death.
Our results seem
to indicate that
a
signaling mechanism mediate
d
by
NKA may have an important role in ant
i
-
tumor
al
action of POH in GBM cells. / GARCIA, D. G. Sinalização de morte celular via NA+, K+-ATPase como alvo de drogas anticâncer: estudos com o álcool perílico. 2013. 86f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2013

Identiferoai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13622
Date January 2013
CreatorsGarcia, Diogo Gomes
ContributorsAlmeida, Cecília Jacques Gonçalves de, Fernandes, Janaina, Ferreira, Luiz Roberto Leão, Silva, Adriana Ribeiro, Gallo, Cláudia Vitória de Moura, Faria Neto, Hugo Caire de Castro
Source SetsIBICT Brazilian ETDs
LanguagePortuguese
Detected LanguagePortuguese
Typeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Sourcereponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ
Rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess

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