El cáncer de mama es la neoplasia maligna más diagnosticada en mujeres y la primera causa de muerte en pacientes con cáncer a nivel mundial. El diagnóstico y el tratamiento precoz son esenciales a la hora de mejorar el pronóstico. De hecho, los avances producidos en los últimos años, han permitido aumentar la supervivencia a 5 años hasta un 90.3%. A pesar de ello, aún existe un porcentaje significativo de pacientes que fallecen, ya que en estadios más avanzados la supervivencia desciende al 29%. Esto, junto a que los fenotipos más agresivos carecen de tratamientos específicos y al desarrollo resistencias a los tratamientos, hace necesaria la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas con valor pronóstico y predictivo. Recientemente, ha crecido el interés por conocer mejor el papel de los puntos de control inmunológicos, así como JAK2 y FoXO1, en la patogénesis y el pronóstico del cáncer de mama. Los puntos de control inmunológicos son una serie de proteínas que, en condiciones fisiológicas, modulan la duración y la amplitud de la respuesta inmunitaria, con el objetivo de evitar un daño excesivo en los tejidos sanos. Sin embargo, en un contexto patológico, las células neoplásicas se aprovechan de sus funciones inhibitorias para escapar de la respuesta activa antineoplásica. Además, recientemente se ha descrito que estas moléculas participan en funciones intrínsecas de las células neoplásicas, favoreciendo su desarrollo y potenciando su agresividad. Los más estudiados han sido CTLA-4, PD1, PDL1 y PDL2. Sin embargo, en los últimos años se han descubierto nuevos miembros de la familia de proteínas B7 como B7-H2, B7-H3 (CD276), B7-H4, B7-H5, B7-H6 y B7-H7, las cuales pueden promover una respuesta coestimuladora o co-inhibidora, en función del receptor al que se unan. Por su parte, JAK2 es una tirosina-quinasa que se asocia a diferentes receptores de membrana, mientras que FoXO1 es un factor de trascripción con un dominio de unión al ADN muy conservado. Ambas proteínas participan en la transcripción de genes implicados en una amplia variedad de procesos fisiológicos, por lo que su desregulación se ha asociado con el desarrollo de diferentes neoplasias, así como con los procesos de metástasis y de evasión de la respuesta inmunitaria. El principal objetivo de la presente tesis doctoral ha sido caracterizar la expresión génica de diferentes puntos de control inmunológicos (CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 y B7-H3) y vías de señalización implicadas en la regulación de la respuesta inmune (JAK2 y FoXO1) en una serie clínica de carcinomas infiltrantes de mama, previamente clasificados en diferentes fenotipos, y correlacionar su expresión con factores clínico-patológicos clásicos y la supervivencia de las pacientes. Los objetivos secundarios fueron corroborar los resultados de expresión génica en líneas celulares representativas de los diferentes inmunofenotipos y evaluar los cambios en la expresión en la generación de mamosferas y de co-cultivos con células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Para ello, se incluyó una serie no consecutiva de 275 pacientes diagnosticadas de carcinoma infiltrante de mama y 6 líneas celulares representativas de los diferentes fenotipos. Además, se utilizó una línea celular de epitelio mamario sano como control y 30 muestras de sangre periférica de pacientes para los cocultivos. La expresión génica se cuantificó mediante qPCR, previa retrotranscripción del ARNm. En nuestra serie clínica observamos que el 95.2% de los tumores sobreexpresaron al menos un punto de control inmunitario. De hecho, CD276 (B7-H3), CD274 (PDL1) y PDCD1 (PD1) fueron los más representativos, mientras que CTLA-4 y PDCD1LG2 (PDL2) junto a JAK2 y FoXO1 mostraron valores de expresión más bajos. En cuanto a la asociación entre genes, observamos que CTLA-4 y PDCD1 (PD1) se correlacionaron significativamente. De modo similar, CD274 (PDL1) y PDCD1LG2 (PDL2) se asociaron entre sí, con los receptores CTLA-4 y PDCD1 (PD1), y con CD276 (B7-H3). Sin embargo, no encontramos correlación entre este último y los receptores CTLA-4 y PDCD1 (PD1). Por su parte, JAK2 se correlacionó con todos los puntos de control inmunológicos, mientras que FoXO1 sólo mostró asociación con los ligandos CD274 (PDL1), PDCD1LG2 (PDL2) y CD276 (B7-H3). Respecto a la correlación con las características clínico-patológicas observamos que CTLA-4 se sobreexpresó en tumores con índice de proliferación intermedio-alto, un alto porcentaje de linfocitos infiltrantes de tumor estromales (sTIL), la ausencia de receptores hormonales y el fenotipo Triple-Negativo. De modo similar, PDCD1 (PD1) se sobreexpresó en tumores con proliferación intermedia y un alto contenido de sTIL, pero en este caso la asociación fue con el fenotipo Luminal B HER2-positivo. En cuanto a CD274 (PDL1) y PDCD1LG2 (PDL2), se sobreexpresaron en tumores HER2-puros pero no de forma significativa. Además, éstos se relacionaron con un alto porcentaje de sTIL y proliferación intermedia, respectivamente. Todo lo anterior apoya que la expresión de estos genes se asocia con características clínicopatológicas desfavorables en cáncer de mama. Por otro lado, CD276 (B7-H3), JAK2 y FoXO1 se sobreexpresaron en fenotipos Luminal A y B HER2-negativos. Asimismo, CD276 (B7-H3) se asoció con tumores con baja proliferación celular y contenido de sTIL, JAK2 con tumores con proliferación intermedia y finalmente FoXO1 con tumores de menor tamaño, de grado histológico II, ausencia de invasión linfovascular y un índice proliferativo bajo-intermedio, siendo todas ellas características favorables. En cuanto al valor pronóstico, no encontramos asociación significativa entre la expresión de nuestros genes de interés y la supervivencia global (SG) de las pacientes. Sólo observamos que las pacientes con tumores que sobreexpresaban FoXO1 tenían una tendencia a vivir más tiempo. En el caso de la supervivencia libre de enfermedad (SLE), vimos que nuestras pacientes desarrollaban menos recidivas cuando sus tumores sobreexpresaban CTLA-4, pudiendo demostrar además su valor como factor independiente. Al estratificar por fenotipos, la sobreexpresión de CTLA-4 mostró una asociación con un buen pronóstico en pacientes con tumores HER2-puros. Tras analizar los resultados en líneas celulares observamos que CTLA-4 se sobrexpresó en las líneas Triple-Negativo (MDA-MB-468 y -231), mientras que PDCD1 (PD1) mantuvo un nivel muy similar en todas las líneas. CD274 (PDL1) y PDCD1LG2 (PDL2) también presentaron un aumento en la línea MDA-MB-231, siendo este aumento significativo en el primero de los casos. Por su parte, CD276 (B7-H3) se encontró sobreexpresado en las líneas Luminales (MCF-7 y BT-474). En contra, JAK2 se infraexpresó en todas las líneas Luminales (MCF- 7, T47-D y BT-474) y la HER2-puro (SK-BR-3). Sin embargo, mostró valores cercanos a la normalidad en la línea MDA-MB-468. Finalmente, FoXO1 se infraexpresó en las líneas más agresivas (BT-474, SK-BR-3 y MDA-MB-231), a excepción de la línea MDA-MB-468, y mostró valores cercanos a la normalidad en las líneas Luminales A (MCF-7 y T47-D). En las mamosferas, observamos que CTLA-4 y CD274 (PDL1) mostraron una expresión similar. Ambos genes se sobreexpresaron en las mamosferas derivadas de BT-474 y SK-BR-3 con respecto a los controles. Sin embargo, en el caso de CTLA-4 se obtuvo un aumento significativo en las mamosferas de MDA-MB-231, mientras que CD274 (PDL1) se comportó de manera contraria. Respecto a PDCD1 (PD1) y PDCD1LG2 (PDL2), ambos estaban sobreexpresados en las mamosferas de MCF-7 y MDA-MB-231 en comparación con los controles, mientras que en el resto se mantuvieron niveles cercanos a la normalidad. En cuanto a CD276 (B7-H3), apreciamos una disminución en las mamosferas derivadas de BT-474, T47-D y SK-BR-3, mientras que las de MCF-7 y MDA-MB-231 presentaron niveles normales. En el caso de JAK2, apreciamos una disminución significativa en las mamosferas de T47-D y BT-474 y un aumento significativo en las de SK-BR-3 y MDA-MB-231. Por último, FoXO1 se mantuvo infraexpresado en todas las mamosferas analizadas, excepto en las obtenidas de MDA-MB-231, las cuales presentaron una expresión normal. Finalmente, en los co-cultivos observamos un gran incremento en la expresión de CTLA-4, PCDC1 (PD1), CD274 (PDL1) y PDCD1LG2 (PDL2) en las células neoplásicas tras interaccionar con las CMSP. Sin embargo, CD276 (B7-H3), JAK2 y FoXO1 mantuvieron unos niveles de expresión génica cercanos a la normalidad. Por otro lado, nuestros resultados también mostraron una variación en la expresión génica en función del tiempo que duró la interacción con las CMSP. Tras evaluar estos resultados conjuntamente, concluimos que la expresión de CTLA-4 se asocia con características clínico-patológicas desfavorables, pudiendo tener un papel relevante en la patogénesis de los tumores Triple-Negativos. Sin embargo, demostró ser un factor independiente de buen pronóstico en cuanto a las recidivas, siendo especialmente favorable en los HER2-puros. Contrariamente, la expresión de CD276 (B7-H3) se asocia con características favorables en tumores Luminales, pero no presenta valor pronóstico. Por su parte, no encontramos asociación entre PDCD1LG2 (PDL2) y los subtipos moleculares ni el valor pronóstico. Además, las discrepancias observadas entre la serie clínica y los ensayos in vitro para PDCD1 (PD1), CD274 (PDL1), JAK2 y FoXO1, estarían reflejando la importancia del microambiente tumoral en el proceso de expresión génica. Respecto a la expresión en mamosferas, observamos que CTLA-4, CD274 (PDL1) y JAK2 aumentan en los fenotipos agresivos, mientras que PDCD1 (PD1) y PDCD1LG2 (PDL2) serían esenciales en los subtipos Luminal A y Triple-Negativo. Sin embargo, CD276 (B7-H3) y FoXO1 parecen no estar implicados en la formación de mamosferas. Por último, los co-cultivos demostraron que la interacción entre células neoplásicas y CMSP estimula la expresión de diferentes puntos de control inmunológicos y vías relacionadas, que pueden promover o inhibir la progresión tumoral. Además, objetivamos una expresión dinámica, pudiendo variar en función del fenotipo tumoral y del tiempo de la interacción.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:ua.es/oai:rua.ua.es:10045/148650 |
| Date | 11 March 2022 |
| Creators | Montoyo-Pujol, Yoel G. |
| Contributors | Peiró, Gloria, Sempere Ortells, José Miguel, Universidad de Alicante. Departamento de Biotecnología |
| Publisher | Universidad de Alicante |
| Source Sets | Universidad de Alicante |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Rights | Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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