Negli ultimi anni, un crescente numero di studiosi ha focalizzato la propria
attenzione sullo sviluppo di strategie che permettessero di caratterizzare le
proprietà ADMET dei farmaci in via di sviluppo, il più rapidamente possibile.
Questa tendenza origina dalla consapevolezza che circa la metà dei farmaci in
via di sviluppo non viene commercializzato perché ha carenze nelle
caratteristiche ADME, e che almeno la metà delle molecole che riescono ad
essere commercializzate, hanno comunque qualche problema tossicologico o
ADME [1].
Infatti, poco importa quanto una molecola possa essere attiva o specifica:
perché possa diventare farmaco è necessario che venga ben assorbita, distribuita
nell’organismo, metabolizzata non troppo rapidamente, ne troppo lentamente e
completamente eliminata. Inoltre la molecola e i suoi metaboliti non dovrebbero
essere tossici per l’organismo.
Quindi è chiaro come una rapida determinazione dei parametri ADMET in fasi
precoci dello sviluppo del farmaco, consenta di risparmiare tempo e denaro,
permettendo di selezionare da subito i composti più promettenti e di lasciar
perdere quelli con caratteristiche negative.
Questa tesi si colloca in questo contesto, e mostra l’applicazione di una tecnica
semplice, la biocromatografia, per caratterizzare rapidamente il legame di
librerie di composti alla sieroalbumina umana (HSA). Inoltre mostra l’utilizzo di
un’altra tecnica indipendente, il dicroismo circolare, che permette di studiare gli
stessi sistemi farmaco-proteina, in soluzione, dando informazioni supplementari
riguardo alla stereochimica del processo di legame.
La HSA è la proteina più abbondante presente nel sangue. Questa proteina
funziona da carrier per un gran numero di molecole, sia endogene, come ad
esempio bilirubina, tiroxina, ormoni steroidei, acidi grassi, che xenobiotici.
Inoltre aumenta la solubilità di molecole lipofile poco solubili in ambiente
acquoso, come ad esempio i tassani. Il legame alla HSA è generalmente
stereoselettivo e ad avviene a livello di siti di legame ad alta affinità. Inoltre è
ben noto che la competizione tra farmaci o tra un farmaco e metaboliti endogeni,
possa variare in maniera significativa la loro frazione libera, modificandone
l’attività e la tossicità.
Per queste sue proprietà la HSA può influenzare sia le proprietà
farmacocinetiche che farmacodinamiche dei farmaci. Non è inusuale che un
intero progetto di sviluppo di un farmaco possa venire abbandonato a causa di
un’affinità troppo elevata alla HSA, o a un tempo di emivita troppo corto, o a
una scarsa distribuzione dovuta ad un debole legame alla HSA. Dal punto di
vista farmacocinetico, quindi, la HSA è la proteina di trasporto del plasma più
importante.
Un gran numero di pubblicazioni dimostra l’affidabilità della tecnica
biocromatografica nello studio dei fenomeni di bioriconoscimento tra proteine e
piccole molecole [2-6].
Il mio lavoro si è focalizzato principalmente sull’uso della biocromatografia
come metodo per valutare le caratteristiche di legame di alcune serie di composti
di interesse farmaceutico alla HSA, e sul miglioramento di tale tecnica. Per
ottenere una miglior comprensione dei meccanismi di legame delle molecole
studiate, gli stessi sistemi farmaco-HSA sono stati studiati anche con il
dicroismo circolare (CD).
Inizialmente, la HSA è stata immobilizzata su una colonna di silice epossidica
impaccata 50 x 4.6 mm di diametro interno, utilizzando una procedura
precedentemente riportata in letteratura [7], con alcune piccole modifiche.
In breve, l’immobilizzazione è stata effettuata ponendo a ricircolo, attraverso
una colonna precedentemente impaccata, una soluzione di HSA in determinate
condizioni di pH e forza ionica. La colonna è stata quindi caratterizzata per
quanto riguarda la quantità di proteina correttamente immobilizzata, attraverso
l’analisi frontale di L-triptofano [8]. Di seguito, sono stati iniettati in colonna
alcune soluzioni raceme di molecole note legare la HSA in maniera
enantioselettiva, per controllare che la procedura di immobilizzazione non
avesse modificato le proprietà di legame della proteina.
Dopo essere stata caratterizzata, la colonna è stata utilizzata per determinare la
percentuale di legame di una piccola serie di inibitori della proteasi HIV (IPs), e
per individuarne il sito(i) di legame. La percentuale di legame è stata calcolata
attraverso il fattore di capacità (k) dei campioni. Questo parametro in fase
acquosa è stato estrapolato linearmente dal grafico log k contro la percentuale
(v/v) di 1-propanolo presente nella fase mobile. Solamente per due dei cinque
composti analizzati è stato possibile misurare direttamente il valore di k in
assenza di solvente organico.
Tutti gli IPs analizzati hanno mostrato un’elevata percentuale di legame alla
HSA: in particolare, il valore per ritonavir, lopinavir e saquinavir è risultato
maggiore del 95%. Questi risultati sono in accordo con dati presenti in
letteratura, ottenuti attraverso il biosensore ottico [9]. Inoltre, questi risultati
sono coerenti con la significativa riduzione di attività inibitoria di questi
composti osservata in presenza di HSA. Questa riduzione sembra essere
maggiore per i composti che legano maggiormente la proteina [10].
Successivamente sono stati eseguiti degli studi di competizione tramite
cromatografia zonale. Questo metodo prevede di utilizzare una soluzione a
concentrazione nota di un competitore come fase mobile, mentre piccole
quantità di analita vengono iniettate nella colonna funzionalizzata con HSA. I
competitori sono stati selezionati in base al loro legame selettivo ad uno dei
principali siti di legame sulla proteina. In particolare, sono stati utilizzati
salicilato di sodio, ibuprofene e valproato di sodio come marker dei siti I, II e
sito della bilirubina, rispettivamente. Questi studi hanno mostrato un legame
indipendente dei PIs ai siti I e II, mentre è stata osservata una debole
anticooperatività per il sito della bilirubina.
Lo stesso sistema farmaco-proteina è stato infine investigato in soluzione
attraverso l’uso del dicroismo circolare. In particolare, è stato monitorata la
variazione del segnale CD indotto di un complesso equimolare
[HSA]/[bilirubina], a seguito dell’aggiunta di aliquote di ritonavir, scelto come
rappresentante della serie. I risultati confermano la lieve anticooperatività per il
sito della bilirubina osservato precedentemente negli studi biocromatografici.
Successivamente, lo stesso protocollo descritto precedentemente è stato
applicato a una colonna di silice epossidica monolitica 50 x 4.6 mm, per valutare
l’affidabilità del supporto monolitico per applicazioni biocromatografiche. Il
supporto monolitico monolitico ha mostrato buone caratteristiche
cromatografiche in termini di contropressione, efficienza e stabilità, oltre che
affidabilità nella determinazione dei parametri di legame alla HSA. Questa
colonna è stata utilizzata per la determinazione della percentuale di legame alla
HSA di una serie di poliamminochinoni sviluppati nell’ambito di una ricerca
sulla malattia di Alzheimer.
Tutti i composti hanno mostrato una percentuale di legame superiore al 95%.
Inoltre, è stata osservata una correlazione tra percentuale di legame è
caratteristiche della catena laterale (lunghezza e numero di gruppi amminici).
Successivamente sono stati effettuati studi di competizione dei composti in
esame tramite il dicroismo circolare in cui è stato evidenziato un effetto
anticooperativo dei poliamminochinoni ai siti I e II, mentre rispetto al sito della
bilirubina il legame si è dimostrato indipendente.
Le conoscenze acquisite con il supporto monolitico precedentemente descritto,
sono state applicate a una colonna di silice epossidica più corta (10 x 4.6 mm). Il
metodo di determinazione della percentuale di legame utilizzato negli studi
precedenti si basa su dati ottenuti con più esperimenti, quindi è necessario molto
tempo prima di ottenere il dato finale. L’uso di una colonna più corta permette
di ridurre i tempi di ritenzione degli analiti, per cui la determinazione della
percentuale di legame alla HSA diventa molto più rapida. Si passa quindi da una
analisi a medio rendimento a una analisi di screening ad alto rendimento (highthroughput-
screening, HTS). Inoltre, la riduzione dei tempi di analisi, permette
di evitare l’uso di soventi organici nella fase mobile.
Dopo aver caratterizzato la colonna da 10 mm con lo stesso metodo
precedentemente descritto per le altre colonne, sono stati iniettati una serie di
standard variando il flusso della fase mobile, per valutare la possibilità di
utilizzare flussi elevati. La colonna è stata quindi impiegata per stimare la
percentuale di legame di una serie di molecole con differenti caratteristiche
chimiche. Successivamente è stata valutata la possibilità di utilizzare una
colonna così corta, anche per studi di competizione, ed è stata indagato il legame
di una serie di composti al sito I. Infine è stata effettuata una valutazione della
stabilità della colonna in seguito ad un uso estensivo.
L’uso di supporti cromatografici funzionalizzati con albumine di diversa
origine (ratto, cane, guinea pig, hamster, topo, coniglio), può essere proposto
come applicazione futura di queste colonne HTS. Infatti, la possibilità di
ottenere informazioni del legame dei farmaci in via di sviluppo alle diverse
albumine, permetterebbe un migliore paragone tra i dati ottenuti tramite
esperimenti in vitro e i dati ottenuti con esperimenti sull’animale, facilitando la
successiva estrapolazione all’uomo, con la velocità di un metodo HTS. Inoltre,
verrebbe ridotto anche il numero di animali utilizzati nelle sperimentazioni.
Alcuni lavori presenti in letteratura dimostrano l’affidabilita di colonne
funzionalizzate con albumine di diversa origine [11-13]: l’utilizzo di colonne più
corte potrebbe aumentarne le applicazioni. / Lately, an increasing number of scientists, academics as well as
pharmaceutical industries, have focused their attention on the development of
strategies to characterise the ADMET properties of the candidate drugs as early
as possible. This trend is due to the awareness that about half of all drugs in
development fail to make it to the market because of ADME deficiencies and
that at least half of the ones that do make it to market still have some ADME or
toxicological problems [1]. No matter how active nor specific is a chemical: to
turn it into drug it needs to be well absorbed, distributed throughout the body,
metabolised in a not too rapid nor too slow way and completely eliminated.
Moreover, it and its metabolites should not be toxic for the body. Thus, it is
clear how a rapid determination of ADMET parameters in early stages of drug
discovery would save money and time, allowing to choose the better compounds
and to eliminate any losers, early and cheaply.
This thesis is set in this context, showing the application of a simple technique,
biochromatography, to quickly evaluate candidate drugs as far as binding to
human serum albumin (HSA) is concerned. Furthermore it shows another
suitable independent technique, namely circular dichroism, able to study the
same drug-protein system, allowing a deeper insight into the stereochemistry of
the binding process.
HSA is the most abundant protein in the blood. It acts as a carrier for a wide
range of molecules either endogenous, such as bilirubin, tiroxine, steroid
hormones and fatty acids, or xenobiotics. Furthermore, it allows the
solubilisation of hydrophobic compounds (e.g. taxanes), characterized by very
low solubility. The binding to albumin is usually stereoselective and occurs at
high-affinity binding sites level. It is also well known that competition of drugs
for the same sites on HSA can meaningfully alter their free fraction affecting
their activity and toxicity. Thus, by its binding properties, HSA can affect the
pharmacokinetics as well as the pharmacodynamic properties of drugs. It is not
unusual that even whole drug discovery projects have been abandoned due to
very strong binding to HSA or short lifetime or poor distribution due to weak
binding. This makes HSA the most important serum protein from a
pharmacokinetics point of view.
A large body of literature has showed the reliability of the biochromatographic
technique for the study of the biorecognition processes between proteins and
small molecules [2-6].
My work was mainly finalised to use this technique to evaluate the binding
characteristics of series of compounds and to improve such technique. To obtain
a better comprehension of the binding mechanisms of the molecules
investigated, circular dichroism was also employed.
First, HSA was immobilised onto a classic packed epoxy silica-based column
50 x 4.6 mm i.d. using a slightly modified procedure previously reported [7]. In
brief, the immobilisation was achieved by overnight recirculation of a solution
of HSA through the column previously packed with epoxy silica particles, at set
pH and ionic strength. Then, the column was characterised in terms of amount
of HSA correctly immobilised by the frontal analysis of L-tryptophan [8]. By
injecting some racemates known to bind the protein in a stereoselective manner,
we also checked that the immobilisation procedure would preserve the binding
properties of the free protein. The column so characterised was employed to
determine the binding percentage of a small series of five HIV protease
inhibitors (PIs), and also it was attempted to identify their binding site(s). The
bound drug percentage was calculated from the capacity factor (k) of the
samples. This parameter in only aqueous phase was extrapolated by linearly
plotting the log k values against the percentage (v/v) of 1-propanol in the eluent
mixtures. Only for two of the five compounds, it has been possible to measure
the k value without organic modifier. All of the IPs analysed proved to strongly
bind HSA; in particular the percentage of binding for ritonavir, lopinavir and
saquinavir was found to be higher than 95%. The results are in agreement with
data achieved by optical biosensor technique previously published [9]. In
addition, these results are consistent with the significant reduction of their
inhibitor activity observed in the presence of HSA. This effect seems to be
greater for the inhibitors strongly bound to the protein [10].
Displacement studies were also performed by zonal elution approach. By this
method, a known concentration of a competitive agent is continuously applied in
the mobile phase to the HSA-based column, while small amounts of the studied
drugs are injected. The competitors employed were chosen for their selective
binding in the main binding areas of HSA. In particular salicylate, ibuprofen,
and valproate were employed as markers of Sudlow’s site I, of Sudlow’s site II,
and of bilirubin site, respectively. The displacement studies have shown an
independent binding of PIs to sites I and II, while a slight anticooperativity was
observed for the bilirubin site. The same system, drug – target protein, was
finally investigated in solution using circular dichroism spectroscopy. The
change in the induced CD spectrum of an equimolar complex HSA/bilirubin was
monitored once increasing amounts of ritonavir, chosen as representative of the
series, were added. The results confirmed a slight anticooperativity for the
bilirubin binding site observed by the biochromatographic approach.
Subsequently, the validation protocol previously described was applied to a
novel 50 mm epoxy silica-based monolithic column to evaluate the reliability of
using such support for biochromatographic studies. That monolithic column
showed good chromatographic characteristics in terms of backpressure,
efficiency and stability as well as reliability in drug binding parameters
determination. Such column was applied in the determination of the binding
percentage to HSA of a series of poliaminoquinones developed within a project
on Alzheimer’s disease. All samples showed a binding percentage higher than
95%. Furthermore, the data obtained showed a good correlation between binding
percentage and side chain chemical features (length and number of amine
groups). Also in this case circular dichroism provided useful information about
the binding sites on HSA of the chemicals studied: displacement studies
indicated an anticooperative binding of these poliaminoquinones to sites I and II,
while an independent binding with respect to bilirubin site was observed.
The knowledge built up with the monolithic support previously described was
applied to a shorter monolithic column (10 x 4.6 mm). The method previously
described for the binding percentage determination is based on the data of
several analyses, so it is time consuming. The use of a shorter column allows
reducing the retention times of analytes. As a consequence the time needed to
determine the binding percentage to HSA of a series of molecules undergo a
tremendous decrease, turning such biochromatography from medium to highthroughput
screening technique. Furthermore, the significant retention time
shortness makes unnecessary the use of organic modifier, like 1-propanol, in the
mobile phase. After the characterisation of the short column as previously
described for the other columns, a series of standards were injected, also by
changing the flow rate in order to evaluate the possibility to use high flows. The
column was than employed to investigate the binding percentage to HSA and the
main binding sites of a series of molecules with different moieties. Finally, the
stability of the column was evaluated, in terms of reliability of results after
repeated analysis.
The development of chromatographic supports based on albumins from other
mammalian species (i.e. rat, dog, guinea pig, hamster, mouse, rabbit) may be
proposed as a future application of these short columns. In fact, this would allow
a better comparison between data achieved by in-vitro experiments and data
collected by experiments on animals, making easier the following data
extrapolation to human, with the speed of an high-throughput screening method.
Moreover it may reduce the number of animals used for pharmacokinetics
investigations. Some papers previously published proved the reliability of these
albumin-based supports [11-13]: using a shorter column may enhance its
applications.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:unibo.it/oai:amsdottorato.cib.unibo.it:1067 |
| Date | 30 May 2008 |
| Creators | Pistolozzi, Marco <1978> |
| Contributors | Bertucci, Carlo |
| Publisher | Alma Mater Studiorum - Università di Bologna |
| Source Sets | Università di Bologna |
| Language | Italian |
| Detected Language | Italian |
| Type | Doctoral Thesis, PeerReviewed |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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