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Previous issue date: 2007-03-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / The development of the biotechnology has permitted to achieve, among other
biotechnological products, many recombinant proteins which are largely used as vaccines,
hormones, enzymes and other ways of human therapeutic activity. This is possible because
the multidisciplinary: through the technology of the recombinant DNA the region that encode
gene of interest is cloned in a system of adequate expression for super-expression of the
correspondent protein and, through the technology of bioprocess is possible to increase the
obtaining scale of the recombinant product assuring its reproducibility, integrity and
functionality. Involving these two areas of knowledge, this works intends to express an
heterolog protein, the Canacistatina, deriving from sugar cane, through an eucariotic
expression system Sf9/baculovirus. This implies in the construction of a recombining
baculovirus, containing the cDNA which codifies to the Canacistatina, and also the
characterization of the cultivation of Sf9 cells, and of the process of infection by baculovirus,
in kinetics and physiologic therms. In order to obtain these purposes it was done experiments
of cultivation of Sf9 cells in Schott bottles of 100 mL, with work volume of 20 mL, in 27° C.
In these experiments it was analyzed the optimum conditions of velocity agitation, inoculum s
density, culture environment, and also the role of substrates. In relation to these parameters, it
was observed that a better cell growth can be conduced in a 100 rpm of agitation, in an
inoculum s density of 1x106 cell/ml, using a combination of 1:1 between the mediums SF900
II and TNM-FH (Medium 50%), without the necessity of addition of Bovine Fetal Sorum.
This last aspect represents a great advantage in relation to the bioprocesses, in a way that it
uses Sf9 cells already known. It was construed the recombining baculovírus containing the
Canacistatina s gene through the modified genome of the baculovirus Autographa californica
Multiple Nuclear Polihedrosis Virus and the infection experiments of Sf9 cells was made
under three MOI values (1, 5 e 10 pfu/cell) in the two culture mediums. The betters results
indicates to infection of Sf9 cells in 50% Medium using MOI= 5 pfu/cell, conditions that the
Canacistatina s productivity reached 28 µg/106cel. / O desenvolvimento da biotecnologia tem permitido a obtenção, entre tantos produtos
biotecnológicos, de muitas proteínas recombinantes utilizadas amplamente como vacinas,
hormônios, enzimas e outras formas de atividade terapêutica humana. Isto é possível através
da multidisciplinaridade, onde por tecnologia do DNA recombinante clona-se a região
codificadora do gene de interesse em um sistema de expressão adequado para super-expressão
da proteína correspondente e, pela tecnologia de bioprocessos torna-se possível o aumento de
escala de obtenção do produto recombinante, garantindo sua reprodutibilidade, integridade e
funcionalidade. Envolvendo estas duas áreas do conhecimento, o presente trabalho tem como
objetivo a expressão de uma proteína heteróloga, a Canacistatina, natural da cana-de-açúcar,
através do sistema de expressão eucariótico células Sf9/baculovírus. Isto abrange a construção
de um baculovírus recombinante, contendo o cDNA que codifica para a Canacistatina, e a
caracterização do cultivo de células Sf9 e do processo de infecção por baculovírus, em termos
cinéticos e fisiológicos. Para estes fins, foram realizados experimentos de cultivo de células
Sf9 em frascos Schott de 100 mL, com volume de trabalho de 20 mL, a 27ºC, nos quais foram
analisadas as condições ótimas de velocidade agitação, densidade de inóculo, meio de cultura
e também o papel dos substratos, obtendo-se que um crescimento celular otimizado pode ser
conduzido a 100 rpm de agitação, com densidade de inóculo de 1x106 cel/ml e utilizando uma
combinação 1:1 entre os meios SF900 II e TNM-FH (Meio 50%), sem a necessidade de
adição de Soro Fetal Bovino. Este último aspecto representa uma grande vantagem em relação
aos bioprocessos utilizando células Sf9 já conhecidos. Foi construído o baculovírus
recombinante contendo o gene da Canacistatina a partir do genoma modificado de
Autographa californica Multiple Nuclear Polihedrosis Virus e os experimentos de infecção de
células Sf9 foram realizados sob três valores de MOI (1, 5 e 10 pfu/cel) nos dois meios de
cultura. Os melhores resultados obtidos apontam para a infecção de células Sf9 em Meio 50%
com MOI de 5,0 pfu/cel, condições nas quais a produtividade de Canacistatina alcançou 28
µg/106cel.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6941 |
| Date | 14 March 2007 |
| Creators | Arantes, Mabel Karina |
| Contributors | Suazo, Cláudio Alberto Torres |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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