CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis that affects humans and animals caused by the dimorphic fungi of the genus Sporothrix. The storage of such microorganisms in culture collections is necessary to monitor the strains of Sporothrix spp. over the years. Despite the existence of effective antifungal therapies against this disease the search for new drugs for the treatment is necessary. Compounds such as farnesol and terpinen-4-ol have been tested against yeasts and filamentous fungi and have shown a broad antifungal spectrum. Thus, the present study aimed to seek new strategies for the preservation of biological and genetic patrimony of the genus Sporothrix, evaluate the in vitro inhibitory activity of farnesol and terpinen-4-ol against strains of Sporothrix spp., as well as evaluating the mechanisms of action of these compounds. Regarding the storage, 20 Sporothrix spp. strains were used and stocked under the following conditions: saline (0.9% NaCl) at 4 ÂC, 10% glycerol plus 10% lactose and 10% glycerol plus 10% sucrose maintained at -20 ÂC and -80 ÂC, stocked in intervals of 3, 6 and 9 months. The viability of the strains was evaluated by the macro and micromorphological aspects. For this purpose, the samples were subcultured in potato agar for seven days at 28 ÂC and evaluated for texture and pigmentation of the strains. For the micromorphological analysis, conidia count was performed using the ranges of 0-10, 10-50, 50-100 and >150 conidia as reference ranges. 40 Sporothrix spp. strains in the filamentous phase were used for the analysis of the inhibitory activity of the terpenes. The study was conducted using broth microdilution assay, described in M38-A2 document, standardized by CLSI. 16 Sporothrix spp. strains were used for the investigation of the mechanism of action of the terpenes in relation to the cell membrane permeability and readings were performed in a spectrophotometer at a wavelength of λ=260 nm, in order to verify the amount of nucleic acid and at λ=280 nm, in order to verify the amount of protein released into the medium. Sporothrix spp. strains showed 100% viability for growth on potato agar in all stock conditions tested, while in relation to the conidia count the stock methods that showed better results were saline at 4 ÂC, glycerol plus lactose and glycerol plus sucrose kept at -20 ÂC. The terpenes farnesol and terpinen-4-ol inhibited all Sporothrix spp. isolates tested with MIC values ranging from 0.015 to 1.0 mM for farnesol (geometric mean of 0.09) and 0.57 to 9.27 mM for terpinen-4-ol (geometric mean of 2.35). CFM values ranged between 0.125 to 4.0 mM and 1.15 to 37.1 mM for farnesol and terpinen-4-ol, respectively. Farnesol was the most active compound for all Sporothrix strains. There was no significant loss of intracellular material after treatment of fungal cells with concentrations of MIC and MIC/2 of terpenes tested when compared to the corresponding untreated samples. Therefore, it was observed that the terpenes showed no ability to lyse the Sporothrix cells, suggesting that its main mechanism of action is not associated with irreversible damage to the cell membrane structure. Thus, further studies are needed to better understand the mechanisms involved in the antifungal activity of the terpenes evaluated. / A esporotricose à uma micose subcutÃnea que acomete humanos e animais, causada pelos fungos dimÃrficos do gÃnero Sporothrix. A estocagem de tais micro-organismos em coleÃÃes de culturas se faz necessÃria para o monitoramento das cepas de Sporothrix spp. ao longo dos anos. Apesar da existÃncia de terapias antifÃngicas eficazes contra esta doenÃa, a busca por novas drogas para o tratamento se faz necessÃria. Compostos como farnesol e terpinen-4-ol foram testados frente a leveduras e fungos filamentosos e tÃm demonstrado um amplo espectro antifÃngico. Desta maneira, o presente trabalho teve por objetivo buscar novas estratÃgias de preservaÃÃo do patrimÃnio biolÃgico e genÃtico de espÃcies do gÃnero Sporothrix, avaliar a atividade inibitÃria in vitro de farnesol e terpinen-4-ol frente a cepas de Sporothrix spp., bem como avaliar os mecanismos de aÃÃo desses compostos. Em relaÃÃo à estocagem foram utilizadas 20 cepas de Sporothrix spp. nas seguintes condiÃÃes: em soluÃÃo salina (NaCl a 0,9%) à 4 ÂC, glicerol 10% acrescido de lactose 10% e glicerol 10% acrescido de sacarose 10% mantidas nas temperaturas de -20 ÂC e -80 ÂC, estocadas nos intervalos de tempo de 3, 6 e 9 meses. A viabilidade das cepas foi avaliada atravÃs dos aspectos macro e micromorfolÃgicos. Para tanto, as amostras foram repicadas em Ãgar batata e, apÃs sete dias de incubaÃÃo a 28 ÂC foram avaliados quanto à textura e pigmentaÃÃo das cepas. Para a anÃlise micromorfolÃgica foi feita a contagem de conÃdios, tendo como referÃncia os seguintes intervalos de 0-10, 10-50, 50-100 e >150 conÃdios. Para a anÃlise da atividade inibitÃria dos compostos foram utilizadas 40 cepas de Sporothrix spp. na fase filamentosa. O estudo foi desenvolvido utilizando ensaio de microdiluiÃÃo em caldo, descrito no documento M38-A2, padronizado pelo CLSI. Para a investigaÃÃo do mecanismo de aÃÃo das drogas em relaÃÃo à permeabilidade da membrana celular, foram utilizadas 16 cepas de Sporothrix spp. e realizadas leituras em espectrofotÃmetro nos comprimentos de onda de λ = 260 nm, com intuito de verificar a quantidade de Ãcido nucleico e λ = 280 nm, com intuito de verificar a quantidade de proteÃna liberada no meio. As cepas de Sporothrix spp. apresentaram viabilidade de 100% para o crescimento em Ãgar batata em todas as condiÃÃes de estoque testadas, enquanto que em relaÃÃo à contagem de conÃdios os mÃtodos de estoque que apresentaram melhor resultado foram a soluÃÃo salina a 4ÂC, glicerol acrescido de lactose e glicerol acrescido de sacarose mantidos a -20ÂC. Os derivados terpÃnicos farnesol e terpinen-4-ol inibiram todos os isolados de Sporothrix spp. testados com valores de CIM variando de 0,015 a 1,0 μM para o farnesol (mÃdia geomÃtrica de 0,09) e de 0,57 a 9,27 mM para terpinen-4-ol (mÃdia geomÃtrica de 2,35). Os valores CFM variaram entre de 0,125 a 4,0 μM e de 1,15 a 37,1 mM para farnesol e terpinen-4-ol, respectivamente. Farnesol foi o composto mais ativo para as todas as cepas de Sporothrix. NÃo houve perda significativa de material intracelular apÃs tratamento das cÃlulas fÃngicas com concentraÃÃes de CIM e CIM/2 dos terpenos testados quando comparados com as correspondentes amostras nÃo tratadas. Dessa forma, foi possÃvel observar que os terpenos nÃo apresentaram capacidade de lise frente Ãs cÃlulas de Sporothrix, o que sugere que seu principal mecanismo de aÃÃo nÃo està relacionado com danos irreversÃveis na estrutura da membrana celular. Assim, novos estudos sÃo necessÃrios para melhor compreensÃo dos mecanismos envolvidos na atividade antifÃngica dos terpenos avaliados.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:9341 |
| Date | 28 April 2014 |
| Creators | Natalya Fechine Silva |
| Contributors | Raimunda SÃmia Nogueira Brilhante, Marcos FÃbio Gadelha Rocha, Tereza de Jesus Pinheiro Gomes Bandeira |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em CiÃncias MÃdicas, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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