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Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Leishmania (Leishmania) amazonensis apresenta mecanismos de adaptação guiados por suas proteinases. Neste contexto, destacam-se as cisteína proteinases (CPs) onde a cisteína proteinase B (CPB) é a CP mais estudada dentre as CPs deste parasito. O foco deste trabalho é a região COOH-terminal da CPB (cyspep), gerada a partir do processamento final desta proteinase. O estudo foi conduzido em cinco fases: obtenção da cyspep recombinante (rcyspep); avaliação da antigenicidade da rcyspep em camundongos experimentalmente infectados com L.(L.) amazonensis; diferenciação in vitro dos promastigotas em amastigotas; avaliação da expressão do gene cpb ao longo da diferenciação do parasito; e detecção da cyspep nas formas promastigotas e amastigotas do parasito. O polipeptídeo rcyspep, de 14 kDa, foi obtida em sistema pET28-a e purificado para posterior produção de anticorpos policlonais específicos em camundongos. Observou-se que, durante a infecção em camundongos, há uma resposta imune humoral contra o rcyspep, caracterizada por um aumento da detecção de anti-cyspep quando comparado com animais de controle (p <0,05). Nos ensaios de diferenciação constatamos três padrões morfológicos ao logo de 96 horas de análise, em uma cinética temporal: formas alongadas com flagelo livre, arredondados com flagelo e arredondadas sem flagelo por microscopia. Adicionalmente a cultura foi analisada por citometria de fluxo demonstrando uma migração gradual da população da região R1 para região R2 do dotplot indicando uma diminuição no tamanho e aumento da granulosidade celular. Observamos que ao longo desta diferenciação ocorre um aumento da quantidade de transcritos do gene cpb, nos tempos de 48 horas (1,3 ×), 72 horas (3,2 ×) e 96 horas (3,4 ×) nas preparações de cDNA dos parasitos, quando comparada com os resultados de quantificação realizados com preparações de cDNA dos promastigotas
Na continuidade deste trabalho, o anti-rcyspep foi utilizado como ferramenta nos estudos de detecção da proteína em preparações de promastigotas e amastigotas obtidas por fracionamento subcelular e no sobrenadante de cultivo por ensaios de ressonância plasmônica de superfície. Os sensorgramas obtidos nestes ensaios revelaram valores de RU de dissociação, indicativos do reconhecimento do anti-rcyspep em todas as preparações do parasito. Constatamos que as proteínas das preparações de membrana e flagelo de ambas as formas têm menor propriedade de ligar a IgG anti-rcyspep. Dentre estas, as preparações de proteína de membrana de amastigota apresentaram os menores valores de Ksat. Por outro lado, os sobrenadantes de cultivo dos promastigotas e amastigotas apresentaram menores quantidades de proteínas reagentes a IgG anti-rcyspep. Adicionalmente, constatamos que as proteínas do parasito reconhecidas pela IgG anti-rcyspep que ligam ao E-64 foram melhor detectadas nas preparações de sobrenadante de cultura de promastigotas (1,4 x 10-2 ng/mm2). O conjunto dos resultados deste trabalho indica que amastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam maior expressão de gene cpb do que promastigota e que ambas as formas lançam o polipeptídio cyspep para o meio extracelular, porém apenas os promastigotas lançam este polipeptídio ainda associada à enzima CPB / Leishmania (Leishmania) amazonensis
presents
adaptive me
chanisms
guided by their
proteinases. In this context, we highlight the cysteine proteinases (CPs) where the cysteine
proteinase B (CPB) is the most studied CP among these parasites. The focus of this work is
the COOH
-
terminal region of CPB (cyspep), gener
ated during the final processing stage of
this proteinase. Our study comprises five main phases: obtaining of a recombinant cyspep
polypeptide (rcyspep); evaluation of the antigenicity of rcyspep in mice experimentally
infected with
L. (L.) amazonensis
; in
vitro
differentiation of promastigotes into amastigotes;
evaluation of cpb gene expression throughout morphological differentiation of the parasite;
and detection of cyspep in promastigotes and amastigotes of L. (L.) amazonensis. The
rcyspep polypeptide,
with 14 kDa, was obtained using a pET28
-
a system and, subsequently,
specific polyclonal antibodies were produced by inoculation in mice. We observed that,
during mice infection, there is a humoral immune response against rcyspep, characterized by
an increa
se in detection of anti
-
cyspep when compared to control animals (p<0.05). During
differentiation assays three morphological patterns could be observed over 96 hours of
observation: elongated shapes with free flagellum, rounded shapes with free flagellum an
d
rounded shapes without visible flagellum. The data point to a gradual migration of the
population of parasites
from
region R1 to r
egion R2
into the dotplot
indicating a decrease in
size and increase in cell granularity. We observed that alongside the mor
phological
differentiation there is an increase in the amount of cpb gene transcripts, in time of 48 hours
(1.3 ×), 72 hours (3.2 ×) and 96 hours (× 3.4), compared with quantitation results obtained
with cDNA of promastigotes. Purified anti
-
rcyspep IgGs we
re lately used as a tool to detect
cyspep in subcellular fractions and culture supernatants of promastigote and amastigote by
surface plasmon resonance assays. The sensorgram obtained from these assays indicate
RU dissociation values that detect the recogn
ition of anti
-
parasite rcyspep in all preparations.
We noticed that membrane and flagellum protein extracts of both parasite forms present
lower capacity to interact with anti
-
rcyspep IgG. The interaction coefficients of each sample
with anti
-
rcyspep IgG w
ere analyzed and we could observe that amastigote membrane
protein preparations have lower Ksat values. Comparatively, the culture supernatants of
amastigotes and promastigotes exhibited
lower p
roportions of rcyspep anti
-
IgG
-
binding
proteins. Additionally,
we found that parasite proteins were recognized by anti
-
IgG rcyspep
that bind to E
-
64 were best detected in promastigote culture supernatant preparations, 1.4 x
10
-
2 ng/mm2 on the chip. Collectively the results indicate that amastigotes
of
L. (L.)
amazone
nsis
exhibit hi
gher expression of cpb gene that
promastigote and that both forms
releases the polypeptide cyspep to the extracellular environment, but
only promastigotes
releases that
polypeptide still associated with
CPB enzyme
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12913 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Souza, Raquel Santos de |
| Contributors | Leon, Leonor Laura, Faria, Suzana Corte Real, Madeira, Maria de Fátima, Santos, Eduardo Caio Torres dos, López, Raquel Elisa da Silva, Alves, Carlos Roberto |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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