CRISPR-Cas systems are highly diverse and canonically function as prokaryotic adaptive immune systems. The canonical resistance mechanism relies on spacers that are complementary to the invaders' nucleic acids. By accidental incorporation or other mechanisms, prokaryotes can also acquire self-targeting spacers that are complementary to their own genome. As self-targeting commonly leads to lethal autoimmunity, the existence of self-targeting spacers poses a paradox. In Chapter 1, we provide an overview of the prevalence of self-targeting spacers, summarize how they can be incorporated, and which means can be employed by the host to evade lethal self-targeting. In addition, we outline alternative functions of CRISPR-Cas systems that are associated with self-targeting spacers. Whether CRISPR-Cas systems can efficiently target their own genome depends heavily on the presence of protospacer adjacent motifs (PAMs) next to the target region. In Chapter 2, we developed a method to determine PAM requirements. Thereby, we specifically focused on type I systems that engage multi-protein complexes, which are challenging to assess. Using the cell-free transcription-translation (TXTL) system, we developed an enrichment-based binding assay and validated its reliability by examining the well-known PAM requirements of the E. coli type I-E system. In Chapter 3, we applied the TXTL-based PAM assay to assess 16 additional CRISPR-Cas systems. These 16 systems included three CRISPR-Cas associated transposons (CASTs). CASTs are recently discovered transposons that employ CRISPR-Cas systems in a non-canonical function for the directed integration of the transposon. To further characterize CASTs in TXTL outside their PAM requirements, we reconstituted the transposition of CASTs in TXTL. In Chapter 4, we turned to non-canonical self-targeting CRISPR-Cas systems, which were already discussed in Chapter 1. While investigating how the plant pathogen Xanthomonas albilineans survives self-targeting by its two endogenous CRISPR-Cas systems, we identified multiple putative anti-CRISPR proteins (Acrs) in the genome of X. albilineans. Two of the Acrs, named AcrIC11 and AcrIF12Xal, inhibited degradation by their respective CRISPR-Cas systems but still retained Cascade-binding ability, and appear responsible for the lack of autoimmunity in X. albilineans. In summary, we developed new technologies that eased the investigation of non-canonical multi-component systems and, if applied to additional systems, might reveal unique properties that could be implemented in new CRISPR-Cas based tools. / CRISPR-Cas-Systeme sind sehr vielfältig und funktionieren kanonisch als prokaryotische adaptive Immunsysteme. Der kanonische Resistenzmechanismus basiert auf Spacern, die komplementär zu den Nukleinsäuren der Eindringlinge sind. Durch zufällige Inkorporation oder andere Mechanismen können Prokaryoten auch Spacer integrieren, die komplementär zu ihrem eigenen Genom sind. Da Selbst-targeting in der Regel zu letaler Autoimmunität führt, stellt die Existenz von selbst-targeting Spacern ein Paradoxon dar. In Kapitel 1 geben wir einen Überblick über die Verbreitung von selbst-targeting Spacern, fassen zusammen, wie sie eingebaut werden können und welche Mittel der Wirt einsetzen kann, um sich dem letalen Selbst-targeting zu entziehen. Darüber hinaus werden alternative Funktionen von CRISPR-Cas-Systemen skizziert, die mit selbst-targeting Spacern in Verbindung gebracht werden. Ob CRISPR-Cas-Systeme Ziele in ihrem eigenen Genom erkennen können, hängt stark davon ab ob bestimmte Motive neben der Zielregion (protospacer adjacent motifs, PAMs) vorhanden sind. In Kapitel 2 haben wir eine Methode entwickelt, um die Anforderungen an PAMs zu bestimmen. Dabei konzentrierten wir uns speziell auf Typ I Systeme, deren Erforschung durch Nutzung von Multiproteinkomplexen erschwert wird. Unter Verwendung des zellfreien Transkriptions-Translations-Systems (TXTL) entwickelten wir einen Test der zur Anreicherung erkannter PAMs führt. Seine Zuverlässigkeit validierten wir, indem wir die bekannten PAM-Anforderungen des E. coli Typ I-E Systems untersuchten. In Kapitel 3 wendeten wir den TXTL-basierten PAM-Assay an, um 16 weitere CRISPR-Cas-Systeme zu untersuchen. Zu diesen 16 Systemen gehörten drei CRISPR-Cas-assoziierte Transposons (CASTs). CASTs sind kürzlich entdeckte Transposons, die CRISPR-Cas-Systeme in einer nicht-kanonischen Funktion für die gerichtete Integration des Transposons einsetzen. Um CASTs in TXTL außerhalb ihrer PAM-Anforderungen weiter zu charakterisieren, haben wir die Transposition von CASTs in TXTL rekonstruiert. In Kapitel 4 wandten wir uns den nicht-kanonischen, selbst-targeting CRISPR-Cas-Systemen zu, die bereits in Kapitel 1 behandelt wurden. Während wir untersuchten, wie das Pflanzenpathogen Xanthomonas albilineans Selbst-targeting durch seine beiden endogenen CRISPR-Cas-Systeme überlebt, identifizierten wir mehrere mutmaßliche Anti-CRISPR-Proteine (Acrs) im Genom von X. albilineans. Zwei dieser Acrs, AcrIC11 und AcrIF12Xal, hemmten die Degradation durch ihre jeweiligen CRISPR-Cas-Systeme, erlaubten aber dennoch DNA-Bindung durch Cascade. Diese beiden Acrs scheinen für das Fehlen von Autoimmunität bei X. albilineans verantwortlich zu sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir neue Technologien entwickelt haben, die die Untersuchung von nicht-kanonischen Mehrkomponentensystemen erleichtert haben und bei Anwendung auf weitere Systeme einzigartige Eigenschaften offenbaren könnten, die in neue CRISPR-Cas-basierte Tools implementiert werden könnten.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:28777 |
| Date | January 2023 |
| Creators | Wimmer, Franziska |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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