IRAK2 besitzt eine Schlüsselrolle im Signalweg des TLR4. Fehlregulationen dieses Signalwegs führen zu fehlgeleiteten Immunreaktionen, die auch die Entstehung und Progression von Krebserkrankungen fördern. Bevor IRAK2 als therapeutisches Ziel in Frage kommen kann, muss erst noch weitere Klarheit über die grundsätzliche Funktionsweise dieses Proteins bestehen. So ist für IRAK2 aufgrund der Substitution einer Aminosäure in der Kinase-Domäne im Vergleich zu IRAK1 noch nicht abschließend geklärt, ob es sich um eine aktive Kinase oder eine Pseudokinase handelt und ob diese Veränderung eine Erhöhung oder eine Erniedrigung der Funktion im TLR4-Signalweg nach sich zieht.
Um diese Fragen anzugehen, wurde in dieser Arbeit Asparagin im vermeintlich aktiven Zentrum (Aminosäure 333) wieder zur Asparaginsäure [N333D] revertiert und damit versucht die Phosphorylierungsaktivität zu steigern bzw. vergleichbar zu IRAK1 wiederherzustellen. Das Einbringen der Mutation in IRAK2 erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Mit dieser und anderen Mutanten und mit wildtypischem IRAK2 wurden durch die CRISPR/Cas9-Methode generierte IRAK2-defiziente 264.7 Makrophagen rekonstituiert und damit ein System etabliert, mit dem der Einfluss der Mutation auf den Signalweg des TLR4 nach Stimulation mit LPS quantitativ analysiert werden konnte. Sowohl die indirekte NF-κB-Messung über CD40-Expression als auch die direkte NF-κB-Messung über die NF-κB-getriebene Expression eines Reportergens (cyan fluorescent protein) ergab, dass IRAK2[N333D] die LPS-abhängige NF-κB-Aktivierung über den TLR4 Signalweg schlechter ermöglicht als IRAK2.
Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die in der Entwicklungsgeschichte aufgetretene Veränderung des aktiven Zentrums von IRAK2 im Vergleich zu IRAK1 zu einer besseren Aktivierung der MyD88-abhängigen NF-κB-Aktivität führte und somit eine erhöhte und länger anhaltende Signalleitung ermöglichte. Diese Erkenntnis kann als weiterer Schritt hin zu einem besseren Verständnis der Funktion des IRAK2-Proteins und zu einer möglichen zukünftigen Verwendung von IRAK2 als Ziel therapeutischer Behandlungen gesehen werden. / Toll-like receptors are fundamental for many immune cells. The protein IRAK2 plays a key role in the signaling pathway downstream of TLR4 and other TLRs. Due to a change at amino acid position 333 of the protein from aspartate (D) to asparagine (N) in the presumed active center of the kinase it is unclear if IRAK2 is an active kinase.
In this research the mutation IRAK2-N333D was investigated thereby trying to reconstitute the evolutionarily original version of the protein. Interestingly, overexpression of IRAK2-N333D in IRAK2-deficient RAW 264.7 cells obtained by using the CRISPR/Cas9-system was less effective in activating LPS-induced CD40 expression and NF-κB activity as compared to wild type IRAK2.
Our results suggest that the evolutionary alteration in the "catalytic center" of IRAK2 led to improved signal transduction thereby allowing longer-lasting activation of the cells. This knowledge might help to better target IRAK2 in therapies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:18067 |
| Date | January 2019 |
| Creators | Zölch, Michael Ludwig |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_mit_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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