The evolutionary success of higher plants is largely attributed to their tremendous developmental
plasticity, which allows them to cope with adverse conditions. However, because these adaptations
require investments of resources, they must be tightly regulated to avoid unfavourable trade-offs.
Most of the resources required are macronutrients based on carbon and nitrogen. Limitations in the
availability of these nutrients have major effects on gene expression, metabolism, and overall plant
morphology. These changes are largely mediated by the highly conserved master kinase SNF1-RELATED
PROTEIN KINASE1 (SnRK1), which represses growth and induces catabolic processes. Downstream of
SnRK1, a hub of heterodimerising group C and S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) transcription factors has
been identified. These bZIPs act as regulators of nutrient homeostasis and are highly expressed in
strong sink tissues, such as flowers or the meristems that initiate lateral growth of both shoots and
roots. However, their potential involvement in controlling developmental responses through their
impact on resource allocation and usage has been largely neglected so far. Therefore, the objective of
this work was to elucidate the impact of particularly S1 bZIPs on gene expression, metabolism, and
plant development.
Due to the high homology and suspected partial redundancy of S1 bZIPs, higher order loss-of-function
mutants were generated using CRISPR-Cas9. The triple mutant bzip2/11/44 showed a variety of robust
morphological changes but maintained an overall growth comparable to wildtype plants. In detail
however, seedlings exhibited a strong reduction in primary root length. In addition, floral transition
was delayed, and siliques and seeds were smaller, indicating a reduced supply of resources to the shoot
and root apices. However, lateral root density and axillary shoot branching were increased, suggesting
an increased ratio of lateral to apical growth in the mutant. The full group S1 knockout
bzip1/2/11/44/53 showed similar phenotypes, albeit far more pronounced and accompanied by
growth retardation. Metabolomic approaches revealed that these architectural changes were
accompanied by reduced sugar levels in distal sink tissues such as flowers and roots. Sugar levels were
also diminished in leaf apoplasts, indicating that long distance transport of sugars by apoplastic phloem
loading was impaired in the mutants. In contrast, an increased sugar supply to the proximal axillary
buds and elevated starch levels in the leaves were measured. In addition, free amino acid levels were
increased in bzip2/11/44 and bzip1/2/11/44/53, especially for the important transport forms
asparagine and glutamine. The increased C and N availability in the proximal tissues could be the cause
of the increased axillary branching in the mutants.
To identify bZIP target genes that might cause the observed shifts in metabolic status, RNAseq
experiments were performed. Strikingly, clade III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET)
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genes were abundant among the differentially expressed genes. As SWEETs are crucial for sugar export
to the apoplast and long-distance transport through the phloem, their reduced expression is likely to
be the cause of the observed changes in sugar allocation. Similarly, the reduced expression of
GLUTAMINE AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), which exhibits glutaminase activity, could be an
explanation for the abundance of glutamine in the mutants. Additional experiments (ATAC-seq, DAP� seq, PTA, q-RT-PCR) supported the direct induction of SWEETs and GAT1_2.1 by S1 bZIPs. To confirm
the involvement of these target genes in the observed S1 bZIP mutant phenotypes, loss-of-function
mutants were obtained, which showed moderately increased axillary branching. At the same time, the
induced overexpression of bZIP11 in axillary meristems had the opposite effect.
Collectively, a model is proposed for the function of S1 bZIPs in regulating sink tissue development. For
efficient long-distance sugar transport, bZIPs may be required to induce the expression of clade III
SWEETs. Thus, reduced SWEET expression in the S1 bZIP mutants would lead to a decrease in apoplastic
sugar loading and a reduced supply to distal sinks such as shoot or root apices. The reduction in long� distance transport could lead to sugar accumulation in the leaves, which would then increasingly be
transported via symplastic routes towards proximal sinks such as axillary branches and lateral roots or
sequestered as starch. The reduced GAT1_2.1 levels lead to an abundance of glutamine, a major
nitrogen transport form. The combined effect on C and N allocation results in increased nutrient
availability in proximal tissues, promoting the formation of lateral plant organs. Alongside emerging
evidence highlighting the power of bZIPs to steer nutrient allocation in other species, a novel but
evolutionary conserved role for S1 bZIPs as regulators of developmental plasticity is proposed, while
the generation of valuable data sets and novel genetic resources will help to gain a deeper
understanding of the molecular mechanisms involved / Der evolutionäre Erfolg höherer Pflanzen wird weitgehend auf ihre enorme Entwicklungsplastizität
zurückgeführt, die es ihnen ermöglicht, widrigen Bedingungen zu trotzen. Da diese Anpassungen
jedoch einen immensen Ressourceneinsatz erfordern, müssen sie streng reguliert werden, um
unvorteilhafte Reaktionen zu vermeiden. Den Großteil der benötigten Ressourcen machen
Makronährstoffe auf der Basis von Kohlenstoff und Stickstoff aus. Eine eingeschränkte Verfügbarkeit
dieser Nährstoffe hat erhebliche Auswirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die
Morphologie der Pflanzen. Diese Veränderungen werden größtenteils durch die hochkonservierte
Kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) vermittelt, die das Wachstum unterdrückt und
katabole Prozesse einleitet. Downstream von SnRK1 wurde ein Netzwerk von heterodimerisierenden
Transkriptionsfaktoren der Gruppe C und S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) identifiziert. Diese bZIPs
wirken als Regulatoren der Nährstoffhomöostase und werden vor allem in starken sink-Geweben wie
Blüten oder den Meristemen, die das Seitenwachstum von Sprossen und Wurzeln ermöglichen,
exprimiert. Ihre potenzielle Beteiligung an der Steuerung von Entwicklungsreaktionen durch ihren
Einfluss auf die Ressourcenzuteilung und -nutzung wurde bisher jedoch weitgehend vernachlässigt.
Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen insbesondere von S1 bZIPs auf die Genexpression,
den Stoffwechsel und die Pflanzenentwicklung zu erforschen.
Aufgrund der hohen Homologie und der vermuteten teilweisen Redundanz der S1 bZIPs wurden
mithilfe von CRISPR-Cas9 loss-of-function Mutanten höherer Ordnung erzeugt. Die Dreifachmutante
bzip2/11/44 zeigte eine Vielzahl robuster morphologischer Veränderungen, behielt aber insgesamt ein
mit Wildtyp-Pflanzen vergleichbares Wachstum bei. Im Detail jedoch wiesen die Keimlinge eine starke
Verringerung der Primärwurzellänge auf. Darüber hinaus verzögerte sich der Blühzeitpunkt, und die
Schoten und Samen waren kleiner, was auf eine geringere Versorgung der Spross- und Wurzelspitzen
mit Ressourcen hinweist. Die Dichte der Seitenwurzeln und die axilläre Verzweigung des Sprosses
waren jedoch erhöht, was auf ein erhöhtes Verhältnis von lateralem zu apikalem Wachstum in der
Mutante hindeutet. Die Knockout-Mutante bzip1/2/11/44/53 zeigte ähnliche Phänotypen, wenn auch
weitaus ausgeprägter und begleitet von Wachstumsverzögerungen. Metabolische Untersuchungen
ergaben, dass diese Veränderungen in der Architektur mit reduzierten Zuckerspiegeln in distalen sink� Geweben wie Blüten und Wurzeln einhergingen. Die Zuckerspiegel waren auch in den Apoplasten der
Blätter vermindert, was darauf hindeutet, dass der Ferntransport von Zucker durch apoplastische
Phloembeladung in den Mutanten beeinträchtigt war. Im Gegensatz dazu wurden eine erhöhte
Zuckerzufuhr zu den proximalen Achselknospen und erhöhte Stärkekonzentrationen in den Blättern
gemessen. Zusätzlich war die Konzentration freier Aminosäuren in bzip2/11/44 und bzip1/2/11/44/53
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erhöht, insbesondere für die wichtigen Transportformen Asparagin und Glutamin. Die erhöhte C- und
N-Verfügbarkeit in den proximalen Geweben könnte die Ursache für die verstärkte axilläre
Verzweigung in den Mutanten sein.
Um bZIP-Zielgene zu identifizieren, die die beobachteten Verschiebungen im Stoffwechselstatus
verursachen könnten, wurden RNAseq-Experimente durchgeführt. Auffallend ist, dass die Gene der
Gruppe III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) unter den unterschiedlich exprimierten
Genen sehr häufig vorkamen. Da SWEETs für den Zuckerexport in den Apoplasten und den
Langstreckentransport durch das Phloem von entscheidender Bedeutung sind, ist ihre verringerte
Expression wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Veränderungen in der Zuckerallokation.
Ebenso könnte die verringerte Expression von GLUTAMIN AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), die
Glutaminase-Aktivität aufweist, eine Erklärung für die Häufigkeit von Glutamin in den Mutanten sein.
Zusätzliche Experimente (ATAC-seq, DAP-seq, PTA, q-RT-PCR) bestätigten die direkte Induktion von
SWEETs und GAT1_2.1 durch S1 bZIPs. Um die Beteiligung dieser Zielgene an den in den S1 bZIP� Mutanten beobachteten Phänotypen zu bestätigen, wurden loss-of-function-Mutanten untersucht,
die eine mäßig erhöhte axilläre Verzweigung aufwiesen. Gleichzeitig hatte die induzierte
Überexpression von bZIP11 in axillären Meristemen den gegenteiligen Effekt.
Auf Basis dieser Ergebnisse wird ein Modell für die Funktion von S1 bZIPs bei der Regulierung der
Entwicklung von sink-Geweben vorgeschlagen. Für einen effizienten Zuckertransport über große
Entfernungen könnten bZIPs erforderlich sein, um die Expression von SWEETs der Gruppe III zu
induzieren. Eine verringerte SWEET-Expression in den S1 bZIP-Mutanten würde zu einem Rückgang der
apoplastischen Zuckerbeladung und einer verringerten Versorgung von distalen sink-Geweben wie den
Spross- oder Wurzelspitzen führen. Die Verringerung des Ferntransports könnte zu einer Anhäufung
von Zucker in den Blättern führen, der dann verstärkt über symplastische Wege zu proximalen sink� Geweben wie den axillären Meristem und Seitenwurzeln transportiert oder als Stärke gespeichert
wird. Die verringerte GAT1_2.1 Expression führt zu einem Überfluss an Glutamin, einer wichtigen
Stickstofftransportform. Die kombinierte Wirkung auf die C- und N-Allokation führt zu einer erhöhten
Nährstoffverfügbarkeit in den proximalen Geweben und fördert die Bildung von seitlichen
Pflanzenorganen. Neben neuen Erkenntnissen, die die Wirksamkeit von bZIPs bei der Steuerung der
Nährstoffallokation in anderen Arten unterstreichen, wird eine neuartige, jedoch evolutionär
konservierte Rolle für S1 bZIPs als Regulatoren der Entwicklungsplastizität vorgeschlagen, während die
Generierung wertvoller Datensätze und neuer genetischer Ressourcen dazu beitragen wird, ein
tieferes Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen zu gewinnen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:32192 |
| Date | January 2024 |
| Creators | Kreisz, Philipp |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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