Os carboidratos são moléculas diversas e complexas que são empregadas por organismos vivos em funções biológicas, como eventos energéticos, estruturais e de sinalização. L-Fucose é um monossacarídeo presente em diversos grupos biológicos, como mamíferos, insetos e plantas. Umas das modificações póstraducionais mais conhecidas contendo L-Fucose são os antígenos do sistema sanguíneo ABO e o leite humano. Alterações no padrão de fucosilação estão relacionadas a patologias como câncer e fucosidose. Essas alterações estão relacionadas ao balanço entre as atividades de α-L-fucosidases e fucosiltransferases. As -L-fucosidases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise de ligações entre resíduos de L-Fucose ligados a outras moléculas. Fucosiltransferases são glicosiltransferases que transferem L-Fucose de GDPfucose para um substrato receptor específico. Embora a importância do metabolismo da fucose, existem poucas informações sobre este assunto em Arthropoda. A literatura indica que fucose, α-L-fucosidases e fucosiltransferases estão envolvidas na interação parasita-hospedeiro em carrapatos, sugerindo que o metabolismo da fucose é essencial para Arachnida. Nosso objetivo foi estudar o metabolismo de fucose em duas espécies de Arachnida: a aranha Nephilingis cruentata e o carrapato Amblyomma sculptum. Ele foi realizado através da caracterização das fucosidases nativas e recombinantes, estrutura e análise in silico, mutagênese sitio-dirigida, padrão de expressão, especificidade e efeito nas células tumorais. Além disso, analisamos as sequências de fucosiltransferases e a expressão por qPCR. As enzimas envolvidas em caminhos metabólicos de fucose também foram investigadas. NcFuc e AsFuc têm um pH ótimo de 5, são inibidas por fucose e fuconojirimicina e apresentam processo de oligomerização dependente de pH. Nós produzimos com sucesso as formas recombinantes dessas enzimas, e elas apresentam as mesmas propriedades cinéticas das formas nativas. A hidrólise de substratos naturais por NcFucr e AsFucr sugerem especificidades diferentes, e ambas conseguiram remover resíduos de fucose de celulares tumorais, reduzindo a invasão celular. Além disso, elas catalisaram reações de transfucosilação. A produção recombinante permitiu a identificação dos resíduos D214 e E59 como díade catalítica em NcFuc. As análises filogenéticas, os dados cinéticos, a modelagem molecular e a especificidade sugerem que os sítios ativos das α-Lfucosidases são diferentes em cada espécie de Arachnida e indicaram que o significado fisiológico da remoção de fucose é diferente entre os organismos. Os ensaios de qPCR evidenciaram que, embora as α-L-fucosidases possam ser enzimas lisossômicas, elas são principalmente expressas no sistema digestório em Arachnida e estão envolvidas na digestão. Representantes de todas as famílias conhecidas de fucosiltransferases foram identificados nos dados do transcriptoma de aranha. No entanto, POFUT1 também foi identificado no nível proteômico e sua análise de expressão indicou uma maior expressão no MG. Isso pode estar relacionado à regeneração de células após a secreção de enzimas digestivas. A análise transcriptômica e proteômica indica que o Arachnida usa vias salvage e de novo para a síntese de fucose. Considerando todos os dados obtidos, concluímos 11 que o metabolismo da fucose está relacionado à digestão em Arachnida, uma vez que eles podem obter a fucose da dieta devido à presença de α-L-fucosidases muito ativas. / Carbohydrates are diverse and complex molecules being employed by living organisms in biological functions such as energetic, structural and signalling events. L-Fucose is a monosaccharide component of many glycans present in a variety of biological groups, such as mammals, insects, and plants. Some of the best-known examples of post-translational modified molecules containing L-Fucose are the ABO blood antigen system and human milk. Changes in the fucosylation pattern are related to pathologies like cancer and fucosidosis. These changes are related to the balance between the activities of α-L-fucosidases and fucosyltransferases. α-Lfucosidases are glycoside hydrolases that catalyse the hydrolysis of glycosidic bonds between residues of L-Fucose to other molecules. Fucosyltransferases are glycosyltransferases which transfer L-Fucose from a GDP-fucose to a specific acceptor. Although the importance of fucose metabolism, there is few information about this subject in Arthropoda. Literature indicates that fucose, α-L-fucosidases and fucosyltransferases are involved in host-pathogen interaction in ticks, suggesting that fucose metabolism is essential to Arachnida. Our aim was to study the metabolism of fucose in two Arachnida species: the spider Nephilingis cruentata and the tick Amblyomma sculptum. This was accomplished through the characterization of native and recombinant fucosidases, structure and in silico analyses, site-directed mutagenesis, expression pattern, specificity and, effect on tumour cells. Besides that, we analysed fucosyltransferases sequences and expression by qPCR. The enzymes involved in fucose metabolic pathways were also investigated. NcFuc and AsFuc have a pH optimum of 5.0, are competitively inhibited by fucose and fuconojirimycin and present an oligomerisation process pH dependent. We successfully produced the recombinant form of these enzymes, and they have the same kinetic properties of native forms. Natural substrate hydrolysis by NcFucr and AsFucr suggest different specificities and they were able to remove fucose residues from tumour cell lines, reducing cell invasion. Moreover, they catalysed transfucosylation reactions. The recombinant production allowed the identification of the residues D214 and E59 as the catalytic dyad in NcFuc. Phylogenetic analysis, kinetic data, molecular modelling, and specificity assays suggest that α-L-fucosidase active sites are different to each Arachnida species and indicated that the physiological significance of fucose removal is different among organisms qPCR assays evidenced that although fucosidases might be lysosomal enzymes, they are mainly expressed at the digestive system in Arachnida and are involved in digestion. Representatives of all known families of fucosyltransferases were identified in the spider MG transcriptome data. However, POFUT1 was also identified at the proteomic level and its expression analysis indicated a higher expression at MG. This might be related to the regeneration of cells after secretion of digestive enzymes. Transcriptomic and proteomic analysis indicate that Arachnida uses both salvage and de novo pathways to fucose synthesis. Considering all the obtained data we concluded that fucose metabolism is related to digestion in Arachnida since they are able to salvage fucose from diet due to the presence of very active α-L-fucosidases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04122018-140405 |
| Date | 03 May 2018 |
| Creators | Perrella, Natalia Nappi |
| Contributors | Rocha, Adriana Rios Lopes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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