Ce travail de doctorat a permis de développer un biocapteur dédié à l’analyse de l'activité hydrolytique d'une enzyme sur un composant de la paroi végétale, l'arabinoxylane, dans un contexte où le nombre d'enzymes à tester augmente.Ce biocapteur permet non seulement de détecter une enzyme active mais également de classer son activité hydrolytique au sein d’un ensemble d’enzyme. L’identification est réalisée simplement à l'œil nu mais le classement nécessite une observation instrumentée. Des techniques de micro-fabrication sont utilisées pour dispenser de manière précise l’arabinoxylane sur un support. La composition de la solution à base d'arabinoxylane a été optimisée afin d’assurer sa stabilité ainsi que l’uniformité de l’épaisseur du dépôt solide. L’influence de la mouillabilité du support est également étudiée. Notre suivi permet de détecter l’hydrolyse enzymatique et de quantifier le taux d’hydrolyse. La fonctionnalité du biocapteur est validée avec une xylanase commerciale par comparaison avec une technique standard en enzymologie utilisant un substrat colorimétrique. Ce nouvel outil a également été évalué sur des enzymes issues de clonage métagénomique. Son seuil de sensibilité est de 3 nkat/ml, comparable aux autres techniques mais permet de diviser par deux le temps d’analyse. / This thesis focused on the development of a biosensor able to detect the hydrolysis capabilities of enzymes. In a context in which an increasing number of enzymes must be tested for their ability to decompose biomass, we choose to use arabinoxylan as our sensor's active layer as it is a major component of plant cell walls. This biosensor doesn’t only make it possible to detect an enzymatic activity but also to rank several enzymes according to their respective activities. While the precise ranking of enzymes requires an instrument, detecting a hydrolytic activity can be done without it. We rely on microfabrication techniques to precisely deposit arabinoxylan on a solid support. We have developed an arabinoxylan based and tuned its composition to maximize its stability and ensure deposits’ homogeneity. The influence of the wetting properties of the support itself was also thoroughly investigated. We are able to quantify the progressive degradation of the arabinoxylan deposits and thus extract the hydrolysis rate. We have benchmarked our approach with the standard techniques (colorimetry) used in enzymology on a commercial Xylanase. Our approach was further evaluated in a metagenomic enzyme screening context. We have demonstrated that while twice faster than the existing techniques, we maintain a limit of detection at the state of the art (3nkat/mL).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015LIL10181 |
| Date | 09 December 2015 |
| Creators | Lamant, Sébastien |
| Contributors | Lille 1, Senez, Vincent |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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