Designade ankyrinupprepningsproteiner (DARPiner) är små, mycket stabila antikroppsmimetiska proteiner. I det här projektet användes anti-EpCAM-DARPiner tillsammans med mikrofluidik för att avgära om de kunde fånga upp HCT116-celler mer effektivt än anti-EpCAM-antikroppar. Ytorna på insidan av mikroffluidikkanaler förändrades genom bindning av N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimidester (GMBS) och merkaptopropyltrietoxysilan (MPTES) för anti-EpCAM-antikroppar och GMBS och (3-aminopropyl)trietoxysilan (APTES) för DARPiner. Båda kanaltyperna testades genom inflöde av cancerceller och helblod blandat med cancerceller. Ingen effektiv och konsekvent celluppfångst åstadkoms trots att det visades att antikropparna och DARPinerna kunde binda till cellerna direkt och att test med fluorescenta DARPiner och antikroppar visade att ytförändringskemin var fungerande. Slutsatsen blev att de mest troliga orsakerna till misslyckandena var att ytförändringskemin påverkade proteinernas bindningsförmåga negativt eller att proteinerna bands till kanalernas yta i fel riktning. DARPiner är fortfarande intressanta för tillämpningar inom mikrofluidik, men vidare förbättring av det experimentella protokollet behövs. / Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) are small and highly stable antibody mimetics. In this project, anti-EpCAM DARPins were used in conjunction with microfluidics to determine if they could capture HCT116 cells more effectively than anti-EpCAM antibodies. The inside surfaces of microfluidic chips were modified using N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS) and mercaptopropyltriethoxysilane (MPTES) for anti-EpCAM antibodies, and surface modifications for anti-EpCAM DARPins were made using GMBS and (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES). Both chip types were tested using cancer cells and whole blood mixed with cancer cells. No effective and consistent cell capture was achieved, despite the antibodies and DARPins being shown to be able to bind to the cells directly and tests with fluorescently labelled DARPins and antibodies showing that the surface modification chemistry used was functional. It was concluded that the most likely causes of the failures were surface modifications interfering with the binding ability of the proteins, or improper orientation of the bound proteins. The DARPin remains a protein of interest for microfluidic applications, but further changes and optimisation of the experimental protocol is necessary.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-299888 |
| Date | January 2021 |
| Creators | Spåre, Emil |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2021:148 |
Page generated in 0.0029 seconds