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Previous issue date: 2017-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / In ethanol production process from hemicellulosic fraction, the use of xylooligomers (XOS)
as substrate reduce the contamination risk, favoring its application at industrial scale. Thus, a
biocatalyst, containing xylanases, xylose isomerase (XI) and yeast co-immobilized in calcium
alginate gel, was developed and XOS simultaneous hydrolysis, isomerization and
fermentation (SHIF) process was studied. Firstly, xylanases from Multifect CX XL A03139
(XAS-5), a commercial enzyme preparation, and the recombinant xylanase from Bacillus
subtilis (XynA) were selected to compose biocatalyst beads. XAS-5 presented better
conversion (78.7%) and higher xylose production in the hydrolysis of beechwood xylan,
while XynA showed exclusive endoxylanase activity. The immobilization and stabilization of
XynA were performed in chitosan-glutaraldehyde, chitosan-glyoxyl and agarose-glyoxyl.
Although the enzyme was efficiently immobilized on all supports, the agarose-glyoxyl-XynA
derivative was notable for exhibiting remarkable stabilization under tested conditions (8600
times). Studies of SHIF process were carried out with birchwood xylan, leading to ethanol
production (0.160 g/g and 0.092 g/L.h) and xylose accumulation, which indicated XI activity
decrease. Further experiments were then performed to to identify possible inhibitors of XI
(pH, Ca2+, Mg2+ and xylooligosaccharides). Ca2+ was identified as an inhibitor, while Mg2+
acts as an activator of the enzyme, and both actions are potentiated at acidic pHs. XI is also
inhibited by XOS, with a decrease of 31.6% in XI activity in the presence of 7.0 g/L of
xylobiose. For this reason, it was decided to evaluate SIF process with a recombinant yeast,
capable of expressing XI. In batch runs, GSE16-T18 (T18) yeast encapsulated in alginate gel
was capable to ferment xylose efficiently, consuming 40 g/L of xylose in 4 h and producing
14.4 g/L of ethanol, with yield of 0.422 g/g and productivity of 3.61 g/L.h. Calcium alginate
gel encapsulation also contributed to protect yeast from the action of inhibitors, such as acetic
acid. The encapsulated T18 was able to perform 10 consecutive cycles in repeated batch
(yeast extract-peptone medium with 40 g/L of xylose), keeping the same productivity and
high yields. It also fermented efficiently sugarcane bagasse hydrolysate, containing 60 g/L of
fermentable sugars and high grade of inhibitors. The modified yeast to be more tolerant to
acetic acid, GSE16-T18 HAA1, was also studied, exhibiting superior performance in
comparison to T18 for hydrolysate fermentations. Continuous experiments were conducted in
a fixed bed reactor using the T18-HAA1 yeast immobilized, with different xylose
concentrations (40, 60, 80 and 120 g/L) in the feed medium. The reactor was operated up to
15 days, without bacterial contamination, with yield of 0.45 g/g, productivity of 4.8 g/L.h and
selectivity of 31 gethanol/gxylitol (60 g/L of xylose in the feed). For the concentrations higher
than 60 g/L, the conversion decreased after 4 days of continuous operation, indicating loss of
cell viability due to hazardous effect of ethanol when present at 30 g/L or more, as well as
limitation of oxygen and nutrients in the system. / No processo de produção de etanol a partir da fração hemicelulósica, a utilização de
xilooligômeros como substrato reduz o risco de contaminação, favorecendo o emprego da
tecnologia em escala industrial. Para isso, um biocatalisador contendo xilanases, xilose
isomerase (XI) e levedura co-imobilizadas em gel de alginato de cálcio foi desenvolvido e o
processo de hidrólise, isomerização e fermentação simultâneos (SHIF) de xilooligômeros foi
estudado. Primeiramente, as xilanases presentes no produto Multifect CX XL A03139 (XAS-
5) e a xilanase recombinante de Bacillus subtilis (XynA) foram selecionadas para compor os
beads do biocatalisador. XAS-5 apresentou melhor conversão (78,7%) e maior produção de
xilose na hidrólise da xilana de faia, enquanto XynA apresentou exclusiva atividade de
endoxilanase. Realizou-se a imobilização e estabilização da XynA em quitosanaglutaraldeído,
quitosana-glioxil e agarose-glioxil. Apesar da enzima ser eficientemente
imobilizada nos três suportes, o derivado agarose-glioxil-XynA se destacou por apresentar
uma estabilização notável nas condições testadas (8600 vezes). Estudos do processo SHIF
foram realizados com xilana de bétula, observando-se produção de etanol (0,160 g/g e 0,092
g/L.h) e acúmulo de xilose, indicando redução da atividade da XI. Realizou-se então, um
estudo para identificar possíveis inibidores da XI (pH, Ca2+, Mg2+ e XOS), constatando-se que
Ca2+ é um inibidor enquanto Mg2+ é um ativador da enzima, sendo suas ações potencializadas
em pHs ácidos. Comprovou-se também que XI é inibida por XOS, observando-se queda da
atividade de XI (31,6%) na presença de 7,0 g/L de xilobiose. Desta forma, tornou-se
interessante avaliar o processo SIF com uma levedura recombinante, capaz de expressar XI.
Em ensaios em batelada, a levedura GSE16-T18 (T18), encapsulada em gel de alginato,
mostrou-se eficiente na fermentação de xilose, consumindo 40 g/L de xilose em 4 h e
produzindo 14,4 g/L de etanol, com rendimento de 0,422 g/g e produtividade de 3,61 g/L.h. O
encapsulamento em gel de alginato de cálcio também protegeu a levedura da ação de
inibidores, como o ácido acético. A T18 encapsulada foi capaz de realizar 10 ciclos
consecutivos em bateladas repetidas (meio contendo extrato de levedura, peptona e 40 g/L de
substrato), mantendo mesma produtividade e elevado rendimento, além de fermentar
eficientemente hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo 60 g/L de açúcares
fermentescíveis e alto teor de inibidores. A levedura GSE16-T18 HAA1, modificada
geneticamente para ser mais tolerante ao ácido acético, foi também estudada, com resultados
superiores a T18 nas fermentações de hidrolisado. Fermentações em modo contínuo foram
realizadas em reator de leito fixo utilizando a levedura T18-HAA1 imobilizada, com
diferentes concentrações de xilose na alimentação (40, 60, 80 e 120 g/L). O reator foi operado
por até 15 dias, sem ocorrência de contaminação por bactérias, com rendimento 0,45 g/g,
produtividade em etanol de 4,8 g/L.h e seletividade de 31 getanol/gxilitol (60 g/L de xilose na
alimentação). Para as concentrações superiores a 60 g/L, a conversão diminuiu após 4 dias de
operação contínua, indicando perda de viabilidade celular devido à ação do etanol quando
presente em concentrações acima de 30 g/L e da limitação de oxigênio e nutrientes no
sistema.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/9179 |
| Date | 30 March 2017 |
| Creators | Milessi, Thais Suzane dos Santos |
| Contributors | Giordano, Raquel de Lima Camargo, Zangirolami, Teresa Cristina |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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